In vitro Measurement of CMP-Sialic Acid Transporter Activity in Reconstituted Proteoliposomes
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Date:
2020-03-20
[Abstract] Nucleotide-sugar transporters (NSTs) facilitate eukaryotic cellular glycosylation by transporting nucleotide-sugar conjugates into the Golgi lumen and endoplasmic reticulum for use by glycosyltransferases, while also transferring nucleotide monophosphate byproducts to the cytoplasm. Mutations in this family of proteins can cause a number of significant cellular pathologies, and wild type members can act as virulence factors for many parasites and fungi. Here, we describe an in vitro assay to measure the transport activity of the CMP-sialic acid transporter (CST), one of seven NSTs ...
[摘要] [ 摘要] 核苷酸糖转运蛋白(NST)通过将核苷酸糖结合物转运到高尔基腔和内质网供糖基转移酶使用,同时将核苷酸单磷酸副产物转移到细胞质中,从而促进了真核细胞的糖基化。该蛋白质家族的突变可引起许多重要的细胞病理,野生型成员可充当许多寄生虫和真菌的致病因子。在这里,我们描述了一种体外测定法,以测量CMP-唾液酸转运蛋白(CST)的转运活性,CMP-唾液酸转运蛋白(CST)是在哺乳动物中发现的七个NST之一。虽然在体外 以前已经针对CST进行了转运分析,但这些研究未能说明以下事实:1 )CMP- 唾液酸(CMP-Sia )的商业库存由约10%的高亲和力CMP组成,以及2)CMP- SIA 是水解d 到CMP和在水溶液中的唾液酸。在这里,我们描述了一种用非选择性磷酸酶南极磷酸酶治疗CMP-Sia的方法,以将所有游离CMP转化为胞苷。这使我们能够准确地测量重组为蛋白脂质体的纯化CST的底物亲和力和运输动力学。
[ 背景技术]一旦在细胞质或细胞核合成,核苷酸偶联的糖被输送到内质网的内腔(ER)由核苷酸-糖转运蛋白(NSTS)或高尔基体(青木等人,2003)。在这些亚细胞区室中,糖基转移酶利用糖部分糖基化脂质和蛋白质,产生副产物核苷酸单磷酸酯(NMP)(Capasso和Hirschberg,1984 ;Milla和Hirschberg ,1989; ...
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Purification of Soluble Recombinant Human Tau Protein from Bacteria Using Double-tag Affinity Purification
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2018-11-20
[Abstract] Dysfunction of the microtubule-associated protein Tau (encoded by the MAPT gene) has been implicated in more than twenty neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s. As such, the physiological and disease-relevant functions of Tau have garnered great interest in the research community. One barrier hampering investigations into the functions of Tau and the generation of pharmacological agents targeting Tau has been the difficulty of obtaining soluble Tau protein in purified form. Here, we describe a protocol that uses dual affinity tag purification to selectively purify soluble ...
[摘要] 微管相关蛋白Tau(由 MAPT 基因编码)的功能障碍已经涉及20多种神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病。 因此,Tau的生理和疾病相关功能引起了研究界的极大兴趣。 妨碍对Tau功能的研究和产生靶向Tau的药理学试剂的一个障碍是难以获得纯化形式的可溶性Tau蛋白。 在这里,我们描述了一种方案,该方案使用双亲和标签纯化从细菌中选择性纯化可溶性重组Tau蛋白,所述细菌对于下游应用具有功能活性,包括免疫,微管结合测定和蛋白质 - 蛋白质相互作用研究。 【背景】Tau传统上被定义为微管结合蛋白;然而,在人类疾病中,Tau可以与轴突微管分离并错误定位到其他神经元区室,包括体细胞,树突和突触,其中与非微管蛋白和结构的相互作用驱动神经元功能障碍(Iqbal et al。 ,2016; Wang和Mandelkow,2016; Zhou et al。,2017; McInnes et al。,2018)。尽管神经原纤维缠结形式的Tau聚集体通常存在于死后患病的脑组织中,但研究表明,可溶性Tau,而不是聚集的Tau,是神经元功能障碍的主要原因(Crimins et al。,2012 ; Polydoro et al。,2014; Koss et al。,2016)。因此,研究Tau在疾病中的可溶性功能,例如鉴定蛋白质 - ...
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Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
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Date:
2018-04-05
[Abstract] GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide.
[摘要] GTP酶是分子开关,在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换,以及与调节蛋白直接相互作用的重构,为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中,我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基(MANT) - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。
【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,调节细胞过程的广度,从蛋白质生物合成到细胞周期进展,从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关,它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时,GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环(G2结构域)的高度保守苏氨酸和开关II环(G3结构域)的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后,与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化,从而使GTPase变为关闭状态(Vetter and ...
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