| An Affinity-directed Protein Missile (AdPROM) System for Targeted Destruction of Endogenous Proteins
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] We recently reported an Affinity-directed PROtein Missile (AdPROM) system for the targeted proteolysis of endogenous proteins of interest (POI) (Fulcher et al., 2016 and 2017). AdPROM consists of the Von Hippel Lindau (VHL) protein, a Cullin 2 E3 ligase substrate receptor (Bosu and Kipreos, 2008), conjugated to a high affinity polypeptide binder (such as a camelid nanobody) that recognises the target protein in cells. When introduced in cells, the target protein is recruited to the CUL2 E3 ubiquitin ligase complex for ubiquitin-mediated proteasomal degradation. For target protein ...
[摘要] 我们最近报道了一种针对内源性感兴趣蛋白（POI）的靶向蛋白水解的亲和指导PROtein导弹（AdPROM）系统（Fulcher等人，2016和2017）。 AdPROM由Von Hippel Lindau（VHL）蛋白组成，Cullin 2 E3连接酶底物受体（Bosu and Kipreos，2008），与识别细胞中靶蛋白的高亲和力多肽结合剂（如骆驼科纳米抗体）缀合。当在细胞中引入时，靶蛋白质被招募到CUL2 E3泛素连接酶复合体用于泛素介导的蛋白酶体降解。对于靶蛋白的募集，我们使用了基于人类III型纤连蛋白结构域的骆驼科动物来源的VHH结构域纳米抗体以及合成多肽单体（Sharm等人，2013; Fridy等人。，2014; Schmidt et al。，2016）。在此协议中，我们描述了生成AdPROM构建体及其在人细胞系中用于靶蛋白质破坏的详细方法。 AdPROM允许对POI进行功能表征，并且其目标蛋白质破坏的效率克服了RNA干扰方法的许多局限性，这些方法需要长时间的治疗并与脱靶效应相关联，而CRISPR / Cas9基因编辑并不总是可行的。
【背景】该协议使人们能够在哺乳动物细胞系中设计，构建和表达AdPROM VHL-nano ...
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| Implantation of Human Peripheral Corneal Spheres into Cadaveric Human Corneal Tissue
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Stem and progenitor cells isolated from human limbal tissue can be cultured in vitro as spheres. These spheres have potential for use as transplantable elements for the repopulation of corneal tissue (Mathan et al., 2016). Herein we describe the detailed protocol for the implantation of human corneal spheres into cadaveric human corneal tissue. This protocol describes the procedure for sphere formation and culture, preparation of tissue for sphere implantation, corneal limbus microsurgery and sphere implantation.
[摘要] 可以将从人角膜缘组织分离的茎细胞和祖细胞作为球体体外培养。 这些球体有可能用作角膜组织再造的可移植元件（Mathan等人，2016）。 这里我们描述了将人角膜球植入尸体人角膜组织的详细方案。 该协议描述了球形成和培养的过程，球体植入组织的制备，角膜缘显微外科手术和球体植入。
【背景】以前的研究集中在隔离角膜缘细胞，这些细胞完全是上皮细胞（角膜缘干细胞）或基质（角质细胞祖细胞），以破译他们在角膜内稳态和伤口修复中的各自角色。 该方案旨在通过其在培养物中形成球体的功能能力来分离角膜缘细胞，并且其本质将包括上皮和间质的多种细胞，其有助于角膜缘的形成。 在分离这些球体之后，我们正在调查其在植入后角膜修复中的潜在用途。 在这里，我们描述了一种用于将这些球体植入人角膜组织和下游分析的体外手术方案。
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| Expression, Purification and Crystallisation of the Adenosine A2A Receptor Bound to an Engineered Mini G Protein
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] G protein-coupled receptors (GPCRs) promote cytoplasmic signalling by activating heterotrimeric G proteins in response to extracellular stimuli such as light, hormones and nucleosides. Structure determination of GPCR–G protein complexes is central to understanding the precise mechanism of signal transduction. However, these complexes are challenging targets for structural studies due to their conformationally dynamic and inherently transient nature. We recently developed an engineered G protein, mini-Gs, which addressed these problems and allowed the formation of a stable GPCR–G ...
[摘要] G蛋白偶联受体（GPCR）通过激活异源三聚体G蛋白来响应细胞外刺激如光，激素和核苷来促进细胞质信号传导。 GPCR-G蛋白复合物的结构测定对于了解信号转导的精确机制至关重要。然而，由于它们的构象动态和固有的短暂性质，这些复合物是结构研究的具有挑战性的目标。我们最近开发了一种工程化的G蛋白，微型G ，解决了这些问题，并允许形成稳定的GPCR-G蛋白复合物。 Mini-G 促进了人腺苷A 2A受体（A 2A 2A）在其G蛋白结合构象中的结构测定，在3.4 Å分辨率。在这里，我们描述了A 2A R R的表达和纯化的一步一步的方案，并且A 2AA-R-mini-G'子>复杂。
背景 我们最近开发了一种工程化的最小G蛋白，迷你G（Carpenter和Tate，2016），其促进了人腺苷A 2A受体的结构测定（A <其活性状态（carpenter等人，2016）。 mini-g="">充分稳定A 2A R的活性构象，以允许络合物在洗涤剂辛硫基葡糖苷中通过蒸气扩散结晶。在这里，我们描述了一种用于表达和纯化Aβ2A ...
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