| Characterising Maturation of GFP and mCherry of Genomically Integrated Fusions in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Single-molecule fluorescence microscopy enables unrivaled sub-cellular quantitation of genomically encoded fusions of native proteins with fluorescent protein reporters. Fluorescent proteins must undergo in vivo maturation after expression before they become photoactive. Maturation effects must be quantified during single-molecule analysis. Here we present a method to characterise maturation of GFP and mCherry genetic protein fusions in budding yeast Saccharomyces cerevisiae.
[摘要] 单分子荧光显微镜技术使天然蛋白与荧光蛋白报告基因的基因组编码融合成为无与伦比的亚细胞定量。 荧光蛋白质在表达后必须进行体内成熟，然后它们变成光敏的。 成熟效应必须在单分子分析过程中进行量化。 在这里，我们提出一种方法来表征GFP和mCherry遗传蛋白融合在芽殖酵母酿酒酵母中的成熟。
【背景】单分子荧光显微技术能够灵敏定量分子化学计量，流动性和拷贝数，不仅在逐个细胞的基础上，而且精确到个别的亚细胞区室（Leake，2012; Wollman和Leake，2015; Shashkova， >等。，2017）。该技术依赖于感兴趣的野生型蛋白质的内源表达的荧光蛋白融合，从而存在一对一的标记。然而，所有荧光蛋白在进入明亮的荧光状态之前的体内成熟时间从几分钟到几十分钟不等（Badrinarayanan等人，2012）。因此，测量任何成熟效应和量化是否存在标记蛋白质的不成熟“暗部分”是最重要的。这些测量也与光漂白（FRAP）后的荧光恢复特别相关。 FRAP可用于研究活细胞中的分子转换（Beattie等人，2017）。 FRAP基于荧光标记组分定位的细胞区域的光漂白，随后定量该区域随时间的任何荧光恢复。可以使用在初始光漂白剂之后作为时间函数的荧光强度之间的测量关系来确定分子迁移率和动力学参数，例如特定荧光组分从分子复合物解离的速率（Leake等人， ...
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| The RiboPuromycylation Method (RPM): an Immunofluorescence Technique to Map Translation Sites at the Sub-cellular Level
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] While isotopic labeling of amino acids remains the reference method in the field for quantifying translation rate, it does not provide any information on spatial localization of translation sites. The rationale behind developing the ribopuromycylation method (RPM) was primarily to map translation sites at the sub-cellular level while avoiding detection of newly synthesized proteins released from ribosomes. RPM visualizes actively translating ribosomes in cells via standard immunofluorescence microscopy in fixed and permeabilized cells using a puromycin-specific monoclonal antibody to detect ...
[摘要] 尽管氨基酸的同位素标记仍然是用于定量翻译速率的领域中的参考方法，但是其不提供关于翻译位点的空间定位的任何信息。 开发ribopuromycylation方法（RPM）的基本原理主要是在亚细胞水平上绘制翻译位点，同时避免检测从核糖体释放的新合成的蛋白质。 RPM通过使用嘌呤霉素特异性单克隆抗体的固定的和透化的细胞中的标准免疫荧光显微镜可视化主动翻译细胞中的核糖体以检测捕获在用链延长抑制剂处理的核糖体上的嘌呤化新生链。
【背景】几十年来，氨基酸的同位素标记被认为是研究蛋白质翻译的金标准。虽然这种方法已被证明是非常准确的评估翻译率，它没有提供翻译核糖体的位置信息。最近，氨基酸类似物使荧光检测新生链（Dieterich等人，2007）。然而，几乎所有检测到的信号都来自核糖体释放的多肽。我们最初的想法是开发一种方法来标记新生链，同时还束缚于翻译核糖体。
嘌呤霉素（PMY）是一种氨基糖苷类抗生素，模拟带电荷的tRNA Tyr并掺入核糖体A位点。因此，PMY通过核糖体催化 - ...
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| Determining Ribosome Translational Status by Ribo-ELISA
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] The Ribo-ELISA was originally developed to elucidate the basis for the ribopuromycylation method (RPM)-based detection of ribosome bound nascent chains. The Ribo-ELISA enables characterization of the translational status of ribosomes, and can be applied to the discovery of super-ribosomal complexes with novel ribosome associated macromolecules that are isolated by physical fractionation in sucrose gradients or other methods.
[摘要] Ribo-ELISA最初是为阐明基于核糖核苷酸化方法（RPM）的核糖体结合新生链检测的基础而开发的。 Ribo-ELISA能够表征核糖体的翻译状态，并且可以应用于通过蔗糖梯度中的物理分离或其他方法分离的新型核糖体相关大分子的超核糖体复合物的发现。
【背景】核糖体是由40S和60S亚单位组成的异构结构，当多个核糖体与单个mRNA结合时，它们以单体和多核糖体存在于细胞中。 另外，翻译核糖体可以与调节翻译的多个分子复合物相关联。 核糖体ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）能够通过核糖体相关新生链的体外嘌呤化检测翻译核糖体（David等人，2012）。 在将嘌呤霉素添加至具有结合的新生链的核糖体时，这种化学反应自发进行。 该方法定量测定每个核糖体中出现的新生链的数量，并且可以用于确定单核细胞相对于多核糖体的翻译状态，并鉴定结合其他大分子的核糖体，其改变其在沉淀柱中的沉降速率或迁移。
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