| Plant ARGONAUTE Protein Immunopurification for Pathogen Cross Kingdom Small RNA Analysis
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Over the last decade, it has been noticed that microbial pathogens and pests deliver small RNA (sRNA) effectors into their host plants to manipulate plant physiology and immunity for infection, known as cross kingdom RNA interference. In this process, fungal and oomycete parasite sRNAs hijack the plant ARGONAUTE (AGO)/RNA-induced silencing complex to post-transcriptionally silence host target genes. We hereby describe the methodological details of how we recovered cross kingdom sRNA effectors of the oomycete pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis during infection of its host plant ...
[摘要] [摘要]在过去的十年中，已经注意到，微生物病原体和害虫将小RNA（sRNA）效应子传递到宿主植物中，以操纵植物生理学和免疫力，称为跨界RNA干扰。在此过程中，真菌和卵菌寄生虫sRNA劫持了植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合体，以转录后沉默宿主靶基因。我们在此描述方法学的细节，我们如何在宿主植物拟南芥感染期间恢复卵菌病原体拟南芥的跨界sRNA效应子。该生物协议包含两个部分：第一，关于植物AGO / sRNA co- 免疫纯化和sRNA回收，用于Illumina高通量测序分析。其次，我们解释了如何进行生物信息学小号斯尔纳序列分析读取可使用Galaxy服务器。原则上，该协议适用于研究来自多种宿主植物和植物相互作用（微生物）的AGO结合的sRNA。
[背景]小RNA（sRNA）可以充当病原体效应物，劫持植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合物（RISC），并使宿主mRNA沉默以进行感染，这种病毒被称为跨界RNA干扰的毒力机制（Weiberg等。，2015； Zeng等，2019）。分析感染期间与植物AGO结合的sRNA的库是一种选择方法，以全面了解可能通过宿主AGO / RISC起作用的植物入侵性病原体sRNA。基于抗体的植物AGO / ...
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| Detection and Analysis of Circular RNAs by RT-PCR
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Gene expression in eukaryotic cells is tightly regulated at the transcriptional and posttranscriptional levels. Posttranscriptional processes, including pre-mRNA splicing, mRNA export, mRNA turnover, and mRNA translation, are controlled by RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding (nc)RNAs. The vast family of ncRNAs comprises diverse regulatory RNAs, such as microRNAs and long noncoding (lnc)RNAs, but also the poorly explored class of circular (circ)RNAs. Although first discovered more than three decades ago by electron microscopy, only the advent of high-throughput RNA-sequencing (RNA-seq) ...
[摘要] 真核细胞中的基因表达在转录和转录后水平受到严格调控。 mRNA转录，mRNA转录和mRNA翻译等后转录过程由RNA结合蛋白（RBPs）和非编码（nc）RNAs控制。大量的ncRNA家族包含多种调控RNA，如microRNAs和长的非编码（lnc）RNAs，但也是探索不足的一类环状RNAs。虽然三十多年前电子显微镜首次发现，但只有高通量RNA测序（RNA-seq）的出现和创新生物信息学管道的开发已经开始允许系统鉴定circRNA（Szabo和Salzman，2016;熊猫，2017b;熊猫等，2017c）。然而，通过RNA测序鉴定的真正的circRNA的验证需要其他分子生物学技术，包括常规或定量（q）聚合酶链反应（PCR）和Northern印迹分析（Jeck和Sharpless，2014）的逆转录（RT）。使用不同引物的环状RNA的RT-qPCR分析已被广泛用于检测，验证和有时定量circRNA（Abdelmohsen等人，2015和2017; Panda等人， ，2017b）。如在此详述的，设计为跨越循环RNA后接连接序列的分歧引物可以特异性扩增circRNA而不是对应的线性RNA。总之，使用不同引物的RT-PCR分析允许直接检测和定量circRNA。
【背景】CircRNAs是共价闭合的，缺少5'或3'末端的单链RNA。虽然它们的起源知之甚少，但它们可以通过称为反向剪接的过程从前体mRNA产生（Panda等人，2017d; ...
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| Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Production of Labeled Probes for Single-molecule FISH or RNA Capture
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Arrays of short, singly-labeled ssDNA oligonucleotides enable in situ hybridization with single molecule sensitivity and efficient transcript specific RNA capture. Here, we describe a simple, enzymatic protocol that can be carried out using basic laboratory equipment to convert arrays of PCR oligos into smFISH and RAP probesets in a quantitative, cost-efficient and flexible way.
[摘要] 短的，单标记的ssDNA寡核苷酸阵列使得能够与单分子灵敏度和有效的转录物特异性RNA捕获进行原位杂交。 在这里，我们描述了一个简单的酶促协议，可以使用基本的实验室设备将PCR寡核苷酸阵列以定量，成本高效和灵活的方式转换为smFISH和RAP探针组。
【背景】合成来源的多个单标记的短寡核苷酸的使用极大地改进了对特异性转录物的高特异性和单分子灵敏度的检测（Femino等人，1998; Raj等人。，2008）。这种探针分子与经典使用的长核酸探针相比具有改进的穿透性并且需要更温和的杂交条件，从而更好地保存标本的结构（例如，Little等人 >，2015，Gaspar 等，2017a）。由于在该设计中多个寡核苷酸 - 通常24-96-靶向相同转录物的不同部分，因此在非特异性背景上在特异性靶分子上发生信号累积，这与由长的多标记探针产生的相等信号相反（Raj ，2008）。此外，由于单个短探针的标记是定量的 - 与长探针的随机标记相反 - ...
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