| Identification of Methylated Deoxyadenosines in Genomic DNA by dA6m DNA Immunoprecipitation
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] dA6m DNA immunoprecipitation followed by deep sequencing (DIP-Seq) is a key tool in identifying and studying the genome-wide distribution of N6-methyldeoxyadenosine (dA6m). The precise function of this novel DNA modification remains to be fully elucidated, but it is known to be absent from transcriptional start sites and excluded from exons, suggesting a role in transcriptional regulation (Koziol et al., 2015). Importantly, its existence suggests that DNA might be more diverse than previously believed, as further DNA modifications might exist in ...
[摘要] 原代小胶质细胞，在单一培养或与神经元或星形胶质细胞共培养，是研究在中枢神经系统（CNS）中小胶质炎症反应和细胞类型特异性相互作用的机制的强大工具。这个协议提供了如何从新生小鼠幼崽制备高纯度原代小胶质细胞的细节。总的步骤包括脑细胞解离，混合胶质细胞培养和小胶质细胞分离。
[背景] 近年来，神经炎症已成为神经科学研究的热点领域。在患有各种神经疾病的患者的脑中观察到炎症反应，例如神经胶质激活和细胞因子上调（Fan等人，2015; Koshimori等人，2015;花园和坎贝尔，2016）。神经炎症不仅被认为是脑中病理变化的结果，而且也是疾病进展的原因（Schwartz等人，2013）。此外，炎症通路的生理功能，其重要性以前被低估，正被揭示为惊人的多才多艺。例如，补体信号通路的激活通常在神经疾病的中枢神经系统（CNS）中观察到，并且被怀疑参与疾病病理生理学（Michailidou等人，2015; Loeffler ...
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| HBV Infection in Human Hepatocytes and Quantification of Encapsidated HBV DNA
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Author:
Date:
2016-01-20
[Abstract] Human hepatic cancer cell lines such as HepG2, Huh7, and HLE cannot get infected with Hepatitis B virus (HBV) due to lack of an HBV receptor(s). Transfection with HBV genome has so far been referred as a tool to mimic HBV infection. However, since sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) was identified as a functional receptor for HBV (Yan et al., 2012), hepatocyte cell lines that were stably transfected with a plasmid for NTCP expression have been used for HBV infection. This protocol is designed for infection with HBV in human hepatocyte cell line HepG2 expressing NTCP ...
[摘要] 人肝癌细胞系如HepG2，Huh7和HLE由于缺乏HBV受体而不能感染乙型肝炎病毒（HBV）。 HBV基因组的转染迄今为止被称为模拟HBV感染的工具。 然而，由于牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）被鉴定为HBV的功能性受体（Yan等人，2012），已经使用用用于NTCP表达的质粒稳定转染的肝细胞细胞系 为HBV感染。 该方案设计用于在表达人类肝细胞细胞系HepG2的表达NTCP（HepG2-hNTCP-C4细胞; Iwamoto等人，2014）或原代人肝细胞（PHH）的HBV感染。 在本节中，我们还描述了用于评估HBV感染的方法之一：细胞内衣壳化的HBV DNA的定量。
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| Identification of Proteins Interacting with Genomic Regions of Interest in vivo Using Engineered DNA-binding Molecule-mediated Chromatin Immunoprecipitation (enChIP)
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Author:
Date:
2014-05-20
[Abstract] Elucidation of molecular mechanisms of genome functions requires identification of molecules interacting with genomic regions of interest in vivo. To this end, it is useful to isolate the target regions retaining molecular interactions. We established locus-specific chromatin immunoprecipitation (ChIP) technologies consisting of insertional ChIP (iChIP) and engineered DNA-binding molecule-mediated ChIP (enChIP) for isolation of target genomic regions (Hoshino and Fujii, 2009; Fujita and Fujii, 2011; Fujita and Fujii, 2012; Fujita and Fujii, 2013a; Fujita and Fujii, 2013b; Fujita et ...
[摘要] 阐明基因组功能的分子机制需要在体内鉴定与感兴趣的基因组区域相互作用的分子。为此，分离保持分子相互作用的靶区是有用的。我们建立由插入ChIP（iChIP）和工程化的DNA结合分子介导的ChIP（enChIP）组成的基因组特异性染色质免疫沉淀（ChIP）技术用于靶基因组区域的分离（Hoshino和Fujii，2009; Fujita和Fujii，和Fujii，2012; Fujita和Fujii，2013a; Fujita和Fujii，2013b; Fujita等人，2013）。与分离的基因组区域相互作用的分子的鉴定和表征有助于理解靶基因组区域的功能的分子机制。在这里，我们描述enChIP，其中工程化的DNA结合分子，如锌指蛋白，转录激活样（TAL）蛋白和催化失活的Cas9（dCas9）加上小指南RNA（gRNA），被用于亲和纯化靶基因组区。 enChIP的方案如下所示：
1。产生锌指蛋白，TAL或dCas9加gRNA以识别感兴趣的基因组区域中的DNA序列。
2。工程化的DNA结合分子与标签和核定位信号（NLS）融合，并在待分析的细胞中表达。如果需要，所得细胞被交联，并裂解，DNA被片段化。将包括工程化DNA结合分子的复合物进行亲和纯化，例如免疫沉淀。分离的复合物保留分子与感兴趣的基因组区域相互作用。 ...
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