| In vitro Cultivation and Visualization of Malaria Liver Stages in Primary Simian Hepatocytes
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] Human liver is the primary and obligatory site for malaria infection where sporozoites invade host hepatocytes. Malaria hepatic stages are asymptomatic and represent an attractive target for development of anti-malarial interventions and vaccines. However, owing to lack of robust and reproducible in vitro culture system, it is difficult to target and study this imperative malaria liver stage. Here, we describe a procedure that allow cultivation and visualization of malaria hepatic stages including dormant hypnozoites using primary simian hepatocytes. This method enables sensitive and ...
[摘要] [摘要 ] 人肝是疟疾感染的主要场所，子孢子侵入宿主肝细胞。疟疾的肝分期是无症状的，并且是开发抗疟疾干预措施和疫苗的有吸引力的目标。然而，由于缺乏健壮和可重现的体外培养系统，因此难以靶向和研究这种必不可少的疟疾肝阶段。在这里，我们描述了一种程序，该程序允许使用原代猿猴肝细胞培养和可视化疟疾肝阶段，包括休眠的次生子。这种方法可以对体外不同肝期进行灵敏和定量的评价。
[背景 ] 疟疾是女性的叮咬后传染给人类按蚊蚊子注入子孢子进入血流，其迁移到肝脏和侵入宿主的肝细胞。在肝细胞内部，子孢子进行第一轮无性繁殖并转化为多核肝裂殖体。完全成熟的肝脏裂殖体破裂并释放裂殖子，该裂殖子进入血流并感染红细胞（RBC）。在红细胞内部，寄生虫进行了第二轮无性繁殖，血液阶段的完成最终引起了与疟疾有关的临床症状。例外地，在所有疟原虫物种中，间日疟原虫，食蟹猴和卵圆形疟原虫的子孢子可产生休眠的肝形式，称为次生子孢子（Prudêncioet al。，2011）。
间日疟原虫是第二大主要疟原虫，在包括热带，亚热带和温带气候在内的所有疟疾物种中地理分布更广。消除间日疟原虫疟疾的最大挑战是由休眠的次生子激活引起的周期性疟疾复发，这些休眠的次生子启动了肝阶段增殖的发作（Wells ...
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| Expression and Ni-NTA-Agarose Purification of Recombinant Hepatitis C Virus E2 Ectodomain Produced in a Baculovirus Expression System
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] In this protocol, we describe the production and purification of the ectodomain of the E2661 envelope protein (amino acids 384-661) of the Hepatitis C virus, which plays a fundamental role in the entry of the virus into the host cell. This protein has been expressed in both prokaryotic and eukaryotic systems but in small quantities or without native protein characteristics. In our case, we use the Baculovirus expression system in insect cells. E2661 is secreted into the extracellular medium and purified by means of affinity chromatography a Ni-NTA-column because the ...
[摘要] 在该协议中，我们描述了丙型肝炎病毒的E2 661 包膜蛋白（氨基酸384-661）的胞外域的产生和纯化，其在病毒进入中起基础作用。 进入宿主细胞。 该蛋白质已经在原核和真核系统中表达，但是少量或没有天然蛋白质特征。 在我们的例子中，我们在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统。 E2 661 被分泌到细胞外培养基中并通过亲和层析Ni-NTA-柱纯化，因为该蛋白质在其氨基末端具有六个组氨酸的标签。 纯化的蛋白质具有天然样构象，并且大量生产，每升约5-6mg。
【背景】丙型肝炎病毒（HCV）是全世界慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的主要原因（Major et al。，2001; Alter，2006）。此时，没有HCV疫苗，抗病毒药物用于治疗HCV感染（Imran et al。，2014）。然而，治疗费用昂贵且不是100％有效（Kohli et al。，2014）。 HCV包膜糖蛋白E2负责与细胞受体的相互作用，因此它是研究病毒感染周期的第一步的主要候选者。由于糖基化和聚集，先前的表达系统产生低水平的异质蛋白质，并且难以区分经历生产性和非生产性折叠的分子（Flint ...
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| Generating Loss-of-function iPSC Lines with Combined CRISPR Indel Formation and Reprogramming from Human Fibroblasts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] For both disease and basic science research, loss-of-function (LOF) mutations are vitally important. Herein, we provide a simple stream-lined protocol for generating LOF iPSC lines that circumvents the technical challenges of traditional gene-editing and cloning of established iPSC lines by combining the introduction of the CRISPR vector concurrently with episomal reprogramming plasmids into fibroblasts. Our experiments have produced nearly even numbers of all 3 genotypes in autosomal genes. In addition, we provide a detailed approach for maintaining and genotyping 96-well plates of iPSC ...
[摘要] 对于疾病和基础科学研究而言，功能丧失（LOF）突变是非常重要的。 在这里，我们提供了一个简单的流线化协议来产生LOF iPSC系列，通过将CRISPR载体与附加型重编程质粒同时引入成纤维细胞，规避了传统基因编辑和已建立的iPSC系的克隆的技术挑战。 我们的实验已经产生了常染色体基因中所有3种基因型的几乎偶数。 此外，我们提供了一个详细的方法来维护和iPSC克隆的96孔板的基因分型。
【背景】CRISPR / Cas9技术允许简单且特异地针对特定基因组位置进行基因编辑。将该技术与诱导性多能干细胞（iPSC）的疾病建模和再生医学潜力相结合将继续对生物医学研究产生前所未有的影响。然而，使CRISPR / Cas9系统适应iPSC已经提出了几个挑战。在细胞系中进行基因编辑的传统方法是用表达Cas9蛋白质的质粒和指导RNA（gRNA）转染细胞，然后产生单克隆并筛选所需的遗传改变。不幸的是，iPSC不适用于单细胞克隆。已经开发了几种补充媒介和克隆方法来克服这一困难，但仍然充满昂贵的设备（低氧培养箱），困难的技术步骤（FACS分选的单个iPSC的存活）或劳动密集型方案（亚克隆）（Forsyth ，2006; Miyaoka ...
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