| Intestinal Co-culture System to Study TGR5 Agonism and Gut Restriction
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] The activation of the Takeda G-protein receptor 5 (TGR5, also known as the G protein-coupled bile acid receptor 1, GPBAR1) in enteroendocrine L-cells results in secretion of the anti-diabetic hormone Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1) into systemic circulation. Consequently, recent research has focused on identification and development of TGR5 agonists as type 2 diabetes therapeutics. However, the clinical application of TGR5 agonists has been hampered by side effects of these compounds that primarily result from their absorption into circulation. Here we describe an in vitro screening protocol ...
[摘要] [摘要]肠内分泌L细胞中的Takeda G蛋白受体5（TGR5，也称为G蛋白偶联胆汁酸受体1，GPBAR1）的激活导致抗糖尿病激素胰高血糖素样肽1的分泌。 （GLP-1）进入全身循环。因此，最近的研究集中于鉴定和开发TGR5激动剂作为2型糖尿病治疗剂。但是，TGR5激动剂的临床应用受到这些化合物的副作用的阻碍，这些副作用主要是由于它们吸收进入循环系统所致。这里我们描述一个体外 筛选协议以评估TGR5激动剂，GLP-1分泌和小分子的肠道限制性特性。该协议涉及在跨孔中将肠道上皮细胞和内分泌细胞一起分化，以评估TGR5激动剂的药效学和化合物对肠道单层的毒性。作为概念的证明，我们证明了该协议在评估有效的TGR5激动剂自然存在的胆汁酸代谢物的性质中的应用。该协议改编自Chaudhari等人。（202 1 ）。
[背景和d ] GI道的肠壁是由几个不同类型的细胞，每一个特定的和，有时独有的功能的（阿莱尔等人。，2018） ...
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| Ratiometric Measurement of Protein Abundance after Transient Expression of a Transgene in Nicotiana benthamiana
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Ratiometric reporters are tools to dynamically measure the relative abundance of a protein of interest. In these systems, a target protein fused to a fluorescent or bioluminescent reporter is expressed with fixed stoichiometry to a reference protein fused to a second reporter. Both fusion proteins are encoded on a single transcript but are separated during translation by a 2A “self-cleaving” peptide. This approach enables changes in the relative abundance of a target protein to be detected sensitively, reducing variability in expression of the ratiometric reporter transgene that may occur ...
[摘要] [摘要] 比率报告基因是动态测量目标蛋白质相对丰度的工具。在这些系统中，与荧光或生物发光报告基因融合的靶蛋白以固定的化学计量比与与第二报告基因融合的参考蛋白表达。两种融合蛋白均编码在单个转录本上，但在翻译过程中被2A“自切割”肽隔开。这种方法使目标蛋白质的相对丰度的变化能够被敏感地检测到，从而减少了可能在不同组织或转化事件中发生的比例报告基因转基因表达的变异性。我们最近开发了一套与网关兼容的植物转化载体，称为pRATIO 结合了多种启动子，荧光和生物发光报告基因以及源自口蹄疫病毒的2A肽。在这里，我们详细描述了如何使用双荧光比率记者pRATIO3212检查靶蛋白的瞬时表达后的相对丰度烟草本塞姆氏叶。对于此示例，我们分析了响应于karrikins 和rac -GR24 处理的拟南芥MAX2 1（SMAX1）蛋白抑制子的降解。该方案提供了一种简单，快速，易于扩展的方法，用于体内分析农杆菌浸润的烟草叶片组织中的相对蛋白质丰度。
[背景] Karrikins （KARs ）是在烟雾中发现的丁烯内酯化合物，可刺激拟南芥种子萌发并增强幼苗的光形态发生（Flematti ，2004； Nelson 等，2009、2010 和2012）。拟南芥中的KAR响应需要α/β- 水解酶KARRIKIN对光的敏感性/低敏感性（KAI2 / HTL）（Sun and Ni，2011; ...
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| Isolation of Primary Human Skeletal Muscle Cells
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Date:
2017-11-05
[Abstract] Primary myoblast culture is a valuable tool in research of muscle disease, pathophysiology, and pharmacology. This protocol describes techniques for dissociation of cells from human skeletal muscle biopsies and enrichment for a highly myogenic population by fluorescence-activated cell sorting (FACS). We also describe methods for assessing myogenicity and population expansion for subsequent in vitro study.
[摘要] 原代成肌细胞培养是研究肌肉疾病，病理生理学和药理学的有用工具。 该协议描述了通过荧光激活细胞分选（FACS）从人类骨骼肌活检中分离细胞并富集高度肌原细胞的技术。 我们还描述了用于评估随后的体外研究中肌原性和群体扩张的方法。
【背景】来自肌肉活组织检查的原代人成肌细胞是模拟体外人体肌肉疾病的有价值的资源。成肌细胞增殖，分化和融合的改变是许多神经肌肉疾病所共有的特征，并且可以用于测定基于细胞的和药理学的治疗。人类骨骼肌活组织检查，尤其是那些受疾病影响的人，通常含有大量的非肌原细胞，如脂肪细胞和成纤维细胞。因此，纯化肌原细胞进行骨骼肌发育和疾病的体外研究是非常重要的。肌肉疾病的早期研究涉及使用组织外植体或未纯化的分离细胞（Geiger和Garvin，1957; Herrmann等人，1960; Goyle等人，1967; Bishop 1971年），后来，Blau和Webster引入了一种预先电镀技术去除成纤维细胞（Blau and ...
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