| Generating Loss-of-function iPSC Lines with Combined CRISPR Indel Formation and Reprogramming from Human Fibroblasts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] For both disease and basic science research, loss-of-function (LOF) mutations are vitally important. Herein, we provide a simple stream-lined protocol for generating LOF iPSC lines that circumvents the technical challenges of traditional gene-editing and cloning of established iPSC lines by combining the introduction of the CRISPR vector concurrently with episomal reprogramming plasmids into fibroblasts. Our experiments have produced nearly even numbers of all 3 genotypes in autosomal genes. In addition, we provide a detailed approach for maintaining and genotyping 96-well plates of iPSC ...
[摘要] 对于疾病和基础科学研究而言，功能丧失（LOF）突变是非常重要的。 在这里，我们提供了一个简单的流线化协议来产生LOF iPSC系列，通过将CRISPR载体与附加型重编程质粒同时引入成纤维细胞，规避了传统基因编辑和已建立的iPSC系的克隆的技术挑战。 我们的实验已经产生了常染色体基因中所有3种基因型的几乎偶数。 此外，我们提供了一个详细的方法来维护和iPSC克隆的96孔板的基因分型。
【背景】CRISPR / Cas9技术允许简单且特异地针对特定基因组位置进行基因编辑。将该技术与诱导性多能干细胞（iPSC）的疾病建模和再生医学潜力相结合将继续对生物医学研究产生前所未有的影响。然而，使CRISPR / Cas9系统适应iPSC已经提出了几个挑战。在细胞系中进行基因编辑的传统方法是用表达Cas9蛋白质的质粒和指导RNA（gRNA）转染细胞，然后产生单克隆并筛选所需的遗传改变。不幸的是，iPSC不适用于单细胞克隆。已经开发了几种补充媒介和克隆方法来克服这一困难，但仍然充满昂贵的设备（低氧培养箱），困难的技术步骤（FACS分选的单个iPSC的存活）或劳动密集型方案（亚克隆）（Forsyth ，2006; Miyaoka ...
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| Proximal Ligation Assay (PLA) on Lung Tissue and Cultured Macrophages to Demonstrate Protein-protein Interaction
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] In this protocol, we describe proximal ligation assay (PLA), an antibody-based detection method for protein-protein interaction. This method relies on specific binding of individual primary antibodies to the two putative interacting proteins. The primary antibodies need to have different hosts. The secondary antibodies against the two hosts have complementary oligonucleotide moieties attached to them. If the two antigens are in close proximity (presumably interacting with each other), the complementary oligonucleotides can anneal and fluorescent nucleotides can be incorporated in a single DNA ...
[摘要] 在这个协议中，我们描述近端连接测定（PLA），一种基于抗体的蛋白质相互作用检测方法。 这种方法依赖于个别一抗与两个推定的相互作用蛋白的特异性结合。 一抗需要有不同的宿主。 针对两种宿主的二抗具有与其连接的互补的寡核苷酸部分。 如果两种抗原紧密接近（推测彼此相互作用），则互补的寡核苷酸可以退火，并且荧光核苷酸可以并入单个DNA聚合步骤中。 在显微镜下，这些反应表现为点状荧光斑点，表明成功的PLA反应并提示两种抗原之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
【背景】近端连接测定法（PLA）是基于抗体的技术，以确定两种蛋白质是否彼此具有40nm。以这种方式检测到的蛋白质可以通过荧光来识别（Ho等人，2012; Banerjee等人，2015）。这使得PLA成为定位蛋白质 - 蛋白质相互作用的极好工具。 Toll样受体（TLR）途径的激活是致病性威胁的先天性免疫应答的重要组成部分。 TLR识别病原体相关分子并诱导信号级联以实现对感染的快速响应。 TLR2和TLR4是TLR家族的两个研究得非常好的成员，它们对不同的刺激有反应。尽管两种受体都响应细菌感染而激活，但只有TLR4响应脂多糖暴露。它们激活一些共享的信号级联，但包括MyD88 / Traf6通路。该途径的诱导包括形成被称为myddosome的信号复合物（Gay等人，2011; Xiong等人，2011; ...
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