| Cell-free Reconstitution of the Packaging of Cargo Proteins into Vesicles at the trans Golgi Network
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Protein sorting at the trans Golgi network (TGN) plays important roles in targeting newly synthesized proteins to their specific destinations. The aim of this proposal is to reconstitute the packaging of non-Golgi resident cargo proteins into vesicles at the TGN, utilizing rat liver cytosol, semi-intact mammalian cells and nucleotides. The protocol describes how to perform the vesicle formation assay, how to isolate vesicles and how to detect cargo proteins in vesicles. This reconstitution assay can be used to quantitatively measure the efficiency of the packaging of a specific cargo ...
[摘要] [摘要] 反式高尔基体网络（TGN）上的蛋白质分选在将新合成的蛋白质靶向其特定目的地方面起着重要作用。该提议的目的是利用大鼠肝细胞溶质，半完整的哺乳动物细胞和核苷酸，在TGN处将非高尔基驻留的货物蛋白重新包装成囊泡。该协议描述了如何进行囊泡形成测定，如何分离囊泡以及如何检测囊泡中的货物蛋白。该重构测定法可用于定量测量在特定实验条件下将特定货物蛋白包装到TGN的运输小泡中的效率。
[背景] 的反式高尔基体网络（TGN）是在分泌运送路径的必要的交通枢纽。为了确保水泡运输的保真度，真核细胞利用各种蛋白质分选设备将特定的货物蛋白质准确地包装到TGN的运输小泡中，然后运至特定的目的地（Guo 等人，2014）。为了加深我们对TGN分选过程特异性的理解，重要的是开发一种能够忠实地重构TGN囊泡形成和货物分选过程的分析方法。该测定法可用于直接和定量地测量特定因子在调节特定货物蛋白包装到运输小泡中的作用。从内质网（ER）将货物蛋白包装到COPII囊泡中的无细胞重构已得到很好的建立（Kim 等，2005; Kim 等，2007; Merte 等，2010; Yuan 等。，2018；Niu 等，2019；）。已经开发出一种体外测定法，其在TGN处重构特定货物蛋白TGN46在运输小泡中的释放（Ponnambalam 等，1996；Wakana ...
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| An Improved Method for Measuring Chromatin-binding Dynamics Using Time-dependent Formaldehyde Crosslinking
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Formaldehyde crosslinking is widely used in combination with chromatin immunoprecipitation (ChIP) to measure the locations along DNA and relative levels of transcription factor (TF)-DNA interactions in vivo. However, the measurements that are typically made do not provide unambiguous information about the dynamic properties of these interactions. We have developed a method to estimate binding kinetic parameters from time-dependent formaldehyde crosslinking data, called crosslinking kinetics (CLK) analysis. Cultures of yeast cells are crosslinked with formaldehyde for various periods ...
[摘要] 甲醛交联广泛用于与染色质免疫沉淀（ChIP）相结合来测量沿着DNA的相对位置以及转录因子（TF）-DNA相互作用的体内相对水平。但是，通常所做的测量不能提供关于这些交互的动态属性的明确信息。我们已经开发了一种方法来评估来自时间依赖性甲醛交联数据的结合动力学参数，称为交联动力学（CLK）分析。酵母细胞的培养物与甲醛交联不同的时间段，在特定位点产生相对的ChIP信号。我们使用质量作用CLK模型来拟合数据，以提取TF-染色质相互作用的动力学参数，包括开关速率和交联速率。从停车费和停车费中我们可以获得停车和停车时间。以下方案是该方法的第二次迭代，CLKv2，更新了改进的交联和淬火条件，更多关于交联速率的信息以及对观察到的动力学模型建模的系统程序。已应用CLKv2分析来研究TATA结合蛋白（TBP）和其他TF的选定子集的结合行为。该协议使用酵母细胞开发，但也可适用于来自其他生物体的细胞。
【背景】转录起始是一个复杂的过程，涉及染色质化启动子上数十种蛋白的协作和协调相互作用（Kim等人，2005; Encode Consortium，2012; Rhee等人， ，2012; Dowen等人，2014年）。许多研究已经研究了体外核心转录机器的组装和调控（Zawel和Reinberg，1992; Conaway和Conaway，1993; Roeder，1996; ...
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| Analysis of Direct Interaction between Viral DNA-binding Proteins by Protein Pull-down Co-immunoprecipitation Assay
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol analyzes the direct interaction between two DNA-binding proteins by pull-down co-immunoprecipitation. One of the proteins is overexpressed in E. coli as HA-tagged recombinant protein and cell-free extracts are immunoprecipitated in HA-affinity resin. Cell extracts are treated with nuclease to degrade DNA and RNA, which rules out nucleic acid-mediated indirect interaction. Then, a second immunoprecipitation step is performed using the purified putative partner protein. Co-immunoprecipitated proteins can be detected either by Coomassie Blue staining and/or Western ...
[摘要] 该协议通过下拉共免疫沉淀分析两种DNA结合蛋白之间的直接相互作用。其中一种蛋白在E中过表达。如HA标记的重组蛋白和无细胞提取物在HA亲和树脂中免疫沉淀。用核酸酶处理细胞提取物以降解DNA和RNA，这排除了核酸介导的间接相互作用。然后，使用纯化的推定的配偶体蛋白进行第二次免疫沉淀步骤。如果特异性抗体可用，可以通过考马斯蓝染色和/或Western印迹（WB）检测免疫共沉淀蛋白质。此外，许多DNA / RNA结合蛋白具有高度正电性，在标准条件下可阻碍WB，正如组蛋白和组蛋白样蛋白所示。在这种情况下，我们表明，假定的合作伙伴的高等电点导致转移不良。提示麻烦WB提供高正电荷DNA结合蛋白的转移。
【背景】共免疫沉淀是分析蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）的常用方法。许多共免疫沉淀方案使用细菌表达的蛋白质。然而，细胞提取物的使用不排除由第三种蛋白介导的间接相互作用，或者在DNA / RNA结合蛋白的情况下介导核酸。
乙型病毒Bam35（B35TP）的末端蛋白含有保守的酪氨酸194，其提供OH基团以在蛋白质引发的DNA复制期间锚定病毒基因组的第一个5'-dTMP。此外，B35TP具有很强的DNA结合能力，与许多DNA结合蛋白一样，它具有非常高的等电点（约10.6），这影响其体外稳定性和功能（Berjón-Otero 等），2016）。 ...
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