| Colorimetric RT-LAMP and LAMP-sequencing for Detecting SARS-CoV-2 RNA in Clinical Samples
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] During pandemics, such as the one caused by SARS-CoV-2 coronavirus, simple methods to rapidly test large numbers of people are needed. As a faster and less resource-demanding alternative to detect viral RNA by conventional qPCR, we used reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). We previously established colorimetric RT-LAMP assays on both purified and unpurified SARS-CoV-2 clinical specimens and further developed a multiplexed sequencing protocol (LAMP-sequencing) to analyze the outcome of many RT-LAMP reactions at the same time (Dao Thi et al., 2020). Extending ...
[摘要] [摘要]在大流行期间（例如由SARS-CoV-2冠状病毒引起的大流行），需要一种简单的方法来快速测试大量人员。作为通过常规qPCR检测病毒RNA的一种更快且资源更少的替代方法，我们使用了逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）。我们先前在纯化和未纯化的SARS-CoV-2临床标本上建立了比色RT-LAMP分析方法，并进一步开发了多重测序方案（LAMP测序）来同时分析许多RT-LAMP反应的结果（Dao Thi等）等人，2020年）。在此工作的基础上，我们在此提供针对RT-LAMP分析和读数的分步操作规程。
[背景]新的SARS-CoV-2冠状病毒构成了重大的公共卫生问题（Li等人，2020年综述）。在缺乏有效的抗病毒治疗和保护性疫苗的情况下，通过大量检测防止局部暴发至关重要。检测SARS-CoV-2感染的标准诊断流程基于以下条件：从临床标本中分离病毒RNA，将RNA转录为cDNA的逆转录（RT）反应以及通过半定量DNA聚合酶链反应进行检测（qPCR）（Corman等，2020）。然而，商业化的RNA分离和RT-qPCR试剂盒价格昂贵，耗时且大流行期间供应短缺，从而限制了高通量测试，需要其他解决方案（Klein等人，2020）。
在我们最近的研究中（Dao ...
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| A Highly Sensitive Anion Exchange Chromatography Method for Measuring cGAS Activity in vitro
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is a pattern recognition receptor (PRR) that senses double stranded DNA (dsDNA) in the cytosol and this leads to the activation of stimulator of interferon genes (STING) via the secondary messenger 2’3’-cyclic GMP-AMP (2’3’-cGAMP). STING then recruits TANK binding kinase 1 (TBK-1) and this complex can phosphorylate and activate interferon regulatory factor 3 (IRF3) leading to the induction of type I interferons and other antiviral genes. The cGAS:DNA complex catalyzes the synthesis of 2’3’-cGAMP and the purpose of the protocol presented here is to measure the in ...
[摘要] 环状GMP-AMP合酶（cGAS）是一种模式识别受体（PRR），可以感知胞质溶胶中的双链DNA（dsDNA），并通过第二信使2'3'来激活干扰素基因刺激物（STING）。环GMP-AMP（2'3'-cGAMP）。然后STING募集TANK结合激酶1（TBK-1），该复合物可磷酸化并激活干扰素调节因子3（IRF3），导致I型干扰素和其他抗病毒基因的诱导。 cGAS：DNA复合物催化2'3'-cGAMP的合成，这里提出的方案的目的是测量在dsDNA存在下纯化的cGAS的体外>活性。开发该方案是为了阐明dsDNA长度与cGAS活性水平之间的关系。该方法涉及与低浓度cGAS和dsDNA的体外>反应，然后使用阴离子交换色谱法定量反应产物。当比较不同DNA片段激活cGAS的能力时，低浓度的cGAS和dsDNA以及该测定的高灵敏度是关键优势。
【背景】细胞胞质内存在双链DNA是DNA或逆转录病毒感染的潜在迹象。核苷酸转移酶cGAS作为感知细胞溶质dsDNA的模式识别受体起作用。 cGAS被dsDNA变构激活并催化ATP和GTP转化为环状二核苷酸2'3'-cGAMP（或简称cGAMP）（Ablasser et al。>，2013; Civril et al 。>，2013; Diner et al。>，2013; Gao et al。>，2013; ...
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| Preparation of Sequencing RNA Libraries through Chemical Cross-linking Coupled to Affinity Purification (cCLAP) in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes consisting of mRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) which control mRNA transcription localization, turnover, and translation. Some mRNAs within the mRNPs have been shown to undergo degradation or storage. Those transcripts can lack general mRNA elements, like the poly(A) tail or 5’ cap structure, which prevent their identification through the application of widely-used approaches like oligo(dT) purification. Here, we describe a modified cross-linking affinity purification protocol (cCLAP) based on existing cross-linking and immunoprecipitation ...
[摘要] 核糖核蛋白颗粒（mRNP）是由mRNA和RNA结合蛋白（RBP）组成的复合物，其控制mRNA转录定位，转换和翻译。已显示mRNP内的一些mRNA经历降解或储存。那些转录物可能缺乏一般的mRNA元件，如poly（A）尾或5'帽结构，这通过应用广泛使用的方法如oligo（dT）纯化来阻止它们的鉴定。在这里，我们描述了基于现有的交联和免疫沉淀（CLIP）方法的修饰的交联亲和纯化方案（cCLAP），以分离mRNP中可被去腺苷酸化，去除和/或部分降解的mRNA，从而开启了检测不同的可能性。非编码RNA（ncRNA）的类型。分离后，将RNA进行衔接子连接，然后进行下一代测序（NGS）。由于快速有效的交联和淬灭步骤，该方案也适用于瞬时诱导的mRNP颗粒。实例包括由外在应激物触发的处理体（PB）或应力颗粒（SG）。其重现性和广泛应用使该方案成为研究特定RNP的RNA组成的有用且有力的工具。
【背景】mRNP内转录物的表征对于理解细胞转录和转录后过程至关重要。通过交联和免疫沉淀，然后通过RNA-Seq从mRNP颗粒中分离RNA已经成为鉴定mRNA靶标的常用方法（Tagwerker et al。，2006; Hafner et al。，2010; Kishore et al。，2011）。 ...
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