| γ-Secretase Epsilon-cleavage Assay
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] γ-Secretase epsilon-cleavage assay is derived from the cell-based Tango assay (Kang et al., 2015), and is a fast and sensitive method to determine the initial cleavage of C99 by γ-secretase. In this protocol, we use HTL cells, which are HEK293 cells with a stably integrated luciferase reporter under the control of the bacterial tetO operator element, in which C99 C terminally fused to a reversed tetracyclin-inducible activator (rTA) transcriptional activator is expressed. Endogenous or transfected γ-secretase cleaves a C terminally fused rTA transcriptional activator from C99, ...
[摘要] γ-分泌酶ε-切割测定来源于基于细胞的Tango测定法（Kang等人，2015），并且是确定γ-分泌酶对C99的初始切割的快速且灵敏的方法。 在该协议中，我们使用HTL细胞，其是在细菌tetO操纵元件的控制下具有稳定整合的萤光素酶报道基因的HEK293细胞，其中C99C末端融合至反向四环素诱导型活化剂（rTA）转录激活剂。 内源性或转染的γ-分泌酶从C99切割C末端融合的rTA转录激活物，允许rTA移动到核以激活萤光素酶报道基因作为γ-分泌酶切割活性的测量。
【背景】阿尔茨海默病（AD）是最普遍的慢性神经退行性疾病。 AD与淀粉样斑块的形成密切相关。这些斑块主要由聚集的β淀粉样蛋白组成，β淀粉样蛋白是由γ-分泌酶裂解淀粉样蛋白前体蛋白的C端99个氨基酸片段（C99）产生的。尽管进行了广泛的努力，γ-分泌酶如何识别其底物尚不清楚。通过将TEV切割位点和转录激活子工程化至GPCR的胞质C末端并连接TEV蛋白酶，设计常规Tango测定以监测GPCR的活化（Barnea等人，2008）到人β-arrestin2。在这里，我们使用内源性或转染的γ-分泌酶切割其底物的跨膜部分，即C99的C末端与rTA融合以建立γ-分泌酶Epsilon切割测定（图1） 。首先建立该测定法以研究γ-分泌酶对C99的初始裂解（Xu等人，2016）。
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| Streptavidin Bead Pulldown Assay to Determine Protein Homooligomerization
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Pulldown assay is a conventional method to determine protein-protein interactions in vitro. Expressing a protein of interest with two different tags allows testing whether both versions can be captured via one of the two tags as homooligomeric complex. This protocol is based on streptavidin bead capture of a biotinylated protein and co-associated Flag-tagged protein using Streptavidin MagBeads.
[摘要] Pulldown分析是一种常规的方法来确定蛋白质在体外的相互作用。 用两种不同的标签表达感兴趣的蛋白质可以检测两种标签是否可以通过两种标签之一作为同低聚体复合物来捕获。 该方案基于使用链霉抗生物素蛋白MagBeads的链霉抗生物素蛋白珠捕获生物素化蛋白质和共结合Flag标记蛋白质。
【背景】淀粉样前体蛋白（APP）可以通过其大的胞外结构域及其跨膜结构域形成同型二聚体，在生物学功能中起重要作用。 目前的方案已被用于表征APP跨膜C-末端99个氨基酸片段（C99）的同二聚化（Yan等人，2017）。 该检测的基本原理如图1所示：链霉亲和素包被的MagBeads可以捕获生物素化的蛋白质，这可以拉下相互作用蛋白质，并通过抗FLAG抗体检测。
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图1.基于MagBeads的pull-down测定的原理在该特定的方案中，使用生物素化的Avi-标记的C99蛋白和相关的C99-TEV位点-rTA-Flag蛋白质。
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| Detection of Membrane Protein Interactions by Cell-based Tango Assays
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The Tango assay is a protein-protein interaction assay, in which a transcription factor (rTA) is fused to a membrane-bound protein via a linker that contains a cleavage site for TEV protease, whereas a soluble interaction partner is fused to TEV protease (Barnea et al., 2008). Association between the two interaction partners leads to an efficient cleavage of the transcription factor, allowing it to translocate to the nucleus and activate a luciferase reporter gene as measurement of the interactions. In this modified assay, we fused one copy of the membrane-spanning amyloid precursor ...
[摘要] Tango测定是蛋白质 - 蛋白质相互作用测定法，其中转录因子（rTA）通过含有TEV蛋白酶切割位点的接头与膜结合蛋白质融合，而可溶性相互作用配偶体与TEV蛋白酶融合（ Barnea et al。，2008）。 两个相互作用伙伴之间的关联导致转录因子的高效切割，使其易位至核并激活荧光素酶报道基因作为相互作用的测量。 在该修改的测定中，我们将膜跨膜淀粉状蛋白前体蛋白（APP）C99区域的一个拷贝与TEV位点rTA（C99-TEV位点rTA）融合，并将另一个拷贝与TEV蛋白酶（C99-TEV）融合以分析膜内 活细胞中的C99-C99相互作用。
【背景】淀粉样蛋白前体蛋白（APP）在其N-末端胞外结构域中具有三个二聚化结构域。此外，APP还可以通过膜结合的C99（C-末端99个氨基酸片段）区域形成二聚体。重要的是，C99二聚化已经与阿尔茨海默氏病（AD）病理学中的Aβ产生相关联。这里所描述的并且在图1中示意性地显示为卡通的Tango测定是用于研究C99和其他膜蛋白的同源二聚化的快速且敏感的方法（Yan等人，2017）。
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图1. ...
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