| Immunofluorescence Analysis of Human Endocervical Tissue Explants Infected with Neisseria gonorrhoeae
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Colonization and penetration of the epithelium is the infection-initiating route of mucosal pathogens. The epithelium counteracts infection by eliciting host cell responses while maintaining the mucosal barrier function. The obligate human sexually transmitted bacterium Neisseria gonorrhoeae, or gonococcus (GC) infects the female reproductive tract primarily from the endocervical epithelium. Due to lack of an infection model that mimics all aspects of human infections in the female reproductive tract, GC pathogenesis is poorly understood. This protocol takes advantage of the ...
[摘要] 上皮的定植和穿透是粘膜病原体的感染启动途径。 上皮细胞通过引发宿主细胞应答来抵抗感染，同时维持粘膜屏障功能。 专性人类性传播细菌淋病奈瑟氏球菌或淋球菌属（GC）主要从宫颈内膜上皮感染女性生殖道。 由于缺乏模仿女性生殖道人类感染的各个方面的感染模型，GC发病机制知之甚少。 该方案利用培养物中繁殖的人宫颈组织的生存力和功能完整性来产生体外感染模型。 这种组织模型保持了感染目标和环境的性质，而没有任何操作，如病毒永生化上皮细胞。 使用免疫荧光显微镜，分析GC与子宫颈上皮细胞的相互作用。
【背景】淋病奈瑟菌（GC）感染人类生殖器上皮，引起淋病，一种常见的性传播感染。女性感染可导致严重的并发症，如盆腔炎，引起输卵管瘢痕和堵塞，易发生异位妊娠或不孕。由于抗生素耐药菌株的流行率增加，淋病又成为重要的公共卫生问题。由于人类是GC的唯一宿主，因此缺乏模仿人类感染各个方面的感染模型是推进我们对GC发病机理的理解的主要障碍。我们建立了人宫颈组织外植体模型和免疫荧光显微镜分析来检测GC感染妇女GC感染的主要部位人间宫颈细胞的机制。这种体外模型保持了宫颈上皮细胞的正常细胞构筑和组织完整性。使用这种模型和免疫荧光分析，我们表明，气相色氨酸定居和渗透到子宫颈组织，在那里他们可能导致症状和播散性淋球菌感染。 ...
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| γ-Secretase Epsilon-cleavage Assay
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] γ-Secretase epsilon-cleavage assay is derived from the cell-based Tango assay (Kang et al., 2015), and is a fast and sensitive method to determine the initial cleavage of C99 by γ-secretase. In this protocol, we use HTL cells, which are HEK293 cells with a stably integrated luciferase reporter under the control of the bacterial tetO operator element, in which C99 C terminally fused to a reversed tetracyclin-inducible activator (rTA) transcriptional activator is expressed. Endogenous or transfected γ-secretase cleaves a C terminally fused rTA transcriptional activator from C99, ...
[摘要] γ-分泌酶ε-切割测定来源于基于细胞的Tango测定法（Kang等人，2015），并且是确定γ-分泌酶对C99的初始切割的快速且灵敏的方法。 在该协议中，我们使用HTL细胞，其是在细菌tetO操纵元件的控制下具有稳定整合的萤光素酶报道基因的HEK293细胞，其中C99C末端融合至反向四环素诱导型活化剂（rTA）转录激活剂。 内源性或转染的γ-分泌酶从C99切割C末端融合的rTA转录激活物，允许rTA移动到核以激活萤光素酶报道基因作为γ-分泌酶切割活性的测量。
【背景】阿尔茨海默病（AD）是最普遍的慢性神经退行性疾病。 AD与淀粉样斑块的形成密切相关。这些斑块主要由聚集的β淀粉样蛋白组成，β淀粉样蛋白是由γ-分泌酶裂解淀粉样蛋白前体蛋白的C端99个氨基酸片段（C99）产生的。尽管进行了广泛的努力，γ-分泌酶如何识别其底物尚不清楚。通过将TEV切割位点和转录激活子工程化至GPCR的胞质C末端并连接TEV蛋白酶，设计常规Tango测定以监测GPCR的活化（Barnea等人，2008）到人β-arrestin2。在这里，我们使用内源性或转染的γ-分泌酶切割其底物的跨膜部分，即C99的C末端与rTA融合以建立γ-分泌酶Epsilon切割测定（图1） 。首先建立该测定法以研究γ-分泌酶对C99的初始裂解（Xu等人，2016）。
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| Streptavidin Bead Pulldown Assay to Determine Protein Homooligomerization
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Pulldown assay is a conventional method to determine protein-protein interactions in vitro. Expressing a protein of interest with two different tags allows testing whether both versions can be captured via one of the two tags as homooligomeric complex. This protocol is based on streptavidin bead capture of a biotinylated protein and co-associated Flag-tagged protein using Streptavidin MagBeads.
[摘要] Pulldown分析是一种常规的方法来确定蛋白质在体外的相互作用。 用两种不同的标签表达感兴趣的蛋白质可以检测两种标签是否可以通过两种标签之一作为同低聚体复合物来捕获。 该方案基于使用链霉抗生物素蛋白MagBeads的链霉抗生物素蛋白珠捕获生物素化蛋白质和共结合Flag标记蛋白质。
【背景】淀粉样前体蛋白（APP）可以通过其大的胞外结构域及其跨膜结构域形成同型二聚体，在生物学功能中起重要作用。 目前的方案已被用于表征APP跨膜C-末端99个氨基酸片段（C99）的同二聚化（Yan等人，2017）。 该检测的基本原理如图1所示：链霉亲和素包被的MagBeads可以捕获生物素化的蛋白质，这可以拉下相互作用蛋白质，并通过抗FLAG抗体检测。
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图1.基于MagBeads的pull-down测定的原理在该特定的方案中，使用生物素化的Avi-标记的C99蛋白和相关的C99-TEV位点-rTA-Flag蛋白质。
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