| Mouse Adipose Tissue Protein Extraction
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] As obesity becomes a global epidemic, the metabolism research field is increasingly focusing on studying the physiological and pathological roles of adipose tissues (AT). However, extracting proteins from AT is challenging due to abundant fat content of intracellular lipid droplets. Several commercial kits for extraction of AT proteins are available, as are protocols (such as the RELi protocol as well as other protein precipitation protocols). The protocols have been introduced to improve the quality and yield of extractions, but these methods either increase the cost or involve multiple ...
[摘要] [摘要 ] 随着肥胖成为全球性流行病，新陈代谢研究领域越来越集中于研究脂肪组织（AT）的生理和病理作用。然而，由于细胞内脂质滴中脂肪含量丰富，从AT中提取蛋白质具有挑战性。可提供用于提取AT蛋白的商业试剂盒，以及方案（例如RELi 该协议已被引入以提高提取的质量和产量，但是这些方法要么增加了成本，要么涉及多个步骤。在此，我们描述了一种基于小鼠AT蛋白提取的详细协议我们的日常实验室操作。该方案仅需非常通用的试剂和仪器即可完成，可在90-120分钟内完成并提供良好的总蛋白质含量回收率。因此，该方案是一种经济诱人，省时且高效的提取方法。来自AT的蛋白质。
[背景 ] 研究脂肪组织（AT）以解决与肥胖症病理生理学相关的问题通常涉及分析AT蛋白质。然而，AT蛋白质样品中的脂质污染严重影响蛋白质定量的准确性，蛋白质印迹图像的质量以及样品处理下游应用对。为了最大限度地减少脂质污染，商业试剂盒已被开发，如分TM 总蛋白提取试剂盒对脂肪组织/脂肪细胞培养S（发明生物技术公司，2017年）。中号矿全面协议的目标是减少脂肪含量，如过量的脂质（的去除RELI ）协议（迪亚兹马林等人，2019）和三氯乙酸（TCA）为基础的蛋白质沉淀法（Benbdelkamel 等人，2018）。尽管提高提取质量已经证实利用在上述过程中，这些方法的缺点也很明显：利用可商购的试剂盒 ...
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| Extraction and Quantification of Polyphosphate (polyP) from Gram-negative Bacteria
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Polyphosphate (polyP), a universally conserved biomolecule, is composed of up to 1,000 phosphate monomers linked via phosphoanhydride bonds. Reaching levels in bacteria that are in the high nmoles per mg protein range, polyP plays important roles in biofilm formation and colonization, general stress protection and virulence. Various protocols for the detection of polyP in bacteria have been reported. These methods primarily differ in the ways that polyP is extracted and/or detected. Here, we report an improved method, in which we combine polyP extraction via binding to glassmilk with a very ...
[摘要] 多磷酸盐（polyP）是一种普遍保守的生物分子，由多达1,000个通过磷酸酐键连接的磷酸盐单体组成。 达到每毫克蛋白质高纳摩尔细菌的水平，polyP在生物膜形成和定植，一般应力保护和毒力中起重要作用。 已经报道了用于检测细菌中polyP的各种方案。 这些方法主要在于提取和/或检测polyP的方式不同。 在这里，我们报告了一种改进的方法，其中我们结合polyP提取通过结合到玻璃奶与非常敏感的PolyP激酶/荧光素酶检测系统。 通过使用该程序，我们显着增强了polyP检测的灵敏度，使其可能适用于哺乳动物组织。
【背景】聚磷酸盐（polyP）是一种由多达1,000种无机磷酸盐单体的直链组成的生物聚合物，存在于生命的所有三个领域的细胞中。然而，细菌是唯一已经充分研究了polyP代谢酶的生物。将ATP转化为polyP的细菌polyP激酶（PPK）催化正向和反向反应。虽然polyP的合成显然是细胞中有利的反应，但通过在体外提供足够量的ADP ，该酶可用于从polyP产生ATP，使得基于荧光素酶的ATP检测成为可能（Ault -Riché et al。，1998）。缺乏PPK的细菌在生物膜形成，运动性，持久性和各种应激反应方面存在缺陷，并显示出对次卤酸（即，漂白）应激或磷酸盐饥饿的显着增加的敏感性（图1）（Rao et al。，2009; Gray et ...
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| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the ...
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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