Liposome Flotation Assay for Studying Interactions Between Rubella Virus Particles and Lipid Membranes
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Rubella virus (RuV) is an enveloped, positive-sense single-stranded RNA virus that is pathogenic to humans. RuV binds to the target cell via the viral envelope protein E1, but the specific receptor molecules on the target cell are yet to be fully elucidated. Here, we describe a protocol for liposome flotation assay to study direct interactions between RuV particles and lipid membranes in a qualitative manner. Interactions are examined by a Nycodenz density gradient fractionation using UV-inactivated RuV particles and fluorescent-labeled liposomes consisting of pure lipids. Fractionated RuV ...
[摘要] 风疹病毒(RuV)是一种包膜的正义单链RNA病毒,对人类具有致病性。 RuV通过病毒包膜蛋白E1与靶细胞结合,但靶细胞上的特异性受体分子尚未完全阐明。在这里,我们描述了脂质体浮选测定的方案,以定性方式研究RuV颗粒和脂质膜之间的直接相互作用。使用UV-灭活的RuV颗粒和由纯脂质组成的荧光标记的脂质体通过Nycodenz密度梯度分级检查相互作用。使用标准十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分级的RuV颗粒,然后对病毒蛋白进行Western印迹分析。在Nycodenz梯度上,与未结合的RuV颗粒相比,与脂质体结合的RuV颗粒转移至较低密度的部分。使用该方案,我们提供了令人信服的证据,即在中性pH下以钙依赖性方式,RuV颗粒与某些细胞类型中含有鞘磷脂(SM)和胆固醇的脂质膜结合。
【背景】 风疹病毒是“风疹”的致病因子,“风疹”是一种急性且相对轻微的全身性感染和“先天性风疹综合征”,一种导致严重出生缺陷的转胎胎儿感染(Hobman,2013)。阐明RuV进入的分子机制对于了解病毒病理学和帮助开发抗RuV药物是必不可少的。虽然以前的研究表明宿主细胞的膜脂质作为RuV受体(Mastromarino et al。,1989和1990; DuBois et ...
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Determination of H+-ATPase Activity in Arabidopsis Guard Cell Protoplasts through H+-pumping Measurement and H+-ATPase Quantification
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Date:
2017-12-20
[Abstract] The opening of stomata in plants in response to blue light is driven by the plasma membrane H+-ATPase in guard cells. To evaluate the activation of the H+-ATPase in vivo, we can use H+-pumping by guard cells in response to blue light and fusicoccin. To do this, it is required to prepare a large amount of guard cell protoplasts and measure H+-pumping in the protoplasts. It is also necessary to determine the protein amount of H+-ATPase. In this protocol, we describe the procedures required for these preparations and measurements.
[摘要] 响应蓝光的植物气孔的开放是由保卫细胞中的质膜H + -ATPase驱动的。 为了评价体内H + -ATP酶的激活,我们可以使用H + +保卫细胞对蓝光的响应,fusicoccin。 为此,需要制备大量的保卫细胞原生质体,并测量原生质体中的H + - 抽吸。 还需要确定H + -ATP酶的蛋白质量。 在这个协议中,我们描述了这些准备和测量所需的程序。
【背景】响应于蓝光的气孔的开放是由穿过保卫细胞质膜上的H +介导的膜超极化驱动的(Assmann等,1985; Shimazaki等人,1986),并且是由质膜H + -ATP酶引起的(Kinoshita和Shimazaki,1999)。 H + -ATP酶在膜上产生电化学梯度,并提供植物细胞中许多次级运输所需的能量。然而,测量体内H + -ATP酶活性并不容易。利用保卫细胞的蓝光敏感特性,我们的方法可以将体内H +泵送作为体内测量H + + 使用拟南芥保卫细胞原生质体的ATP酶活性(Ueno等人,2005)。与通过蛋白质印迹(Yamauchi等人,2016)的Hβ+ -ATPase定量一起,该方法允许比较Hβ+ -ATPase活性不同的条件或突变背景。
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