| Medaka-microinjection with an Upright Microscope
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] We described a simple method for microinjecting DNA/RNA/Protein solutions into medaka eggs under an upright microscope. Medaka is an excellent vertebrate model for reverse genetics, because of its daily spawning, short generation time, and egg transparency. These features enable us to efficiently perform functional genomic analyses of transgenic or genome edited fish. This protocol contains the initial steps necessary to create various types of genetically modified fish.
[摘要] 我们已经描述了在直立显微镜下将DNA / RNA /蛋白质溶液显微注射到青eggs蛋中的简单方法。 青aka是一种优秀的反向遗传学脊椎动物模型，因为其每日产卵，短代时间和卵子透明度。 这些特征使我们能够有效地进行转基因或基因组编辑的鱼的功能基因组分析。 该协议包含了创建各种转基因鱼所需的初始步骤。
【背景】青aka是一种小型的淡水硬骨鱼物种，具有脊椎动物模型的特征，包括每日产卵，完整的基因组序列和一些有用菌株的可用性。此外，其蛋的透明度是通过显微注射将DNA / RNA /蛋白质溶液精确地引入蛋的细胞质中。显微注射对于功能基因组分析是重要的;例如，DNA显微注射是产生转基因鱼的不可缺少的技术，并且有助于理解体内基因的功能（Ozato等人，1986）。此外，CRISPR / Cas系统的显微注射能够实现靶向基因组编辑，如敲除和敲入方法（Ansai和Kinoshita，2014，Murakami等人，2017a）。
立体显微镜和直立显微镜均可用于鱼胚胎显微注射。虽然直立显微镜的显微注射正处于不稳定的状态。在本文中，我们描述了一个直立显微镜显微注射法的轮廓。该方法可以与其他方案一起使用，例如用于产生基因敲除或基因敲入系的方案（Ansai和Kinoshita，2014，Murakami等人，2017b）。
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| Genotyping-free Selection of Double Allelic Gene Edited Medaka Using Two Different Fluorescent Proteins
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] This protocol describes a simple genotyping using two different colors of fluorescent protein genes inserted at the target locus. This method makes it possible to determine the genotype of each individual simply by observing the fluorescence later than F1 generation.
[摘要] 该协议描述了使用两种不同颜色的荧光蛋白基因插入目标基因座的简单基因分型。这种方法可以简单地通过观察比F1代更晚的荧光来确定每个个体的基因型。
【背景】由于基因组编辑动物的常规基因分型在很大程度上取决于基于PCR的基因分型，所以有必要提取基因组DNA。在青aka中，尾鳍是一种易于再生的组织，因此经常用于基因分型以保持鱼的活力。要切断尾鳍，必须喂鱼几周，使其长得足够大（体长约1厘米）。喂养和照顾许多鱼费时费力。因此，希望减少繁殖早期如胚和早期幼虫的鱼的数量，以减少任务。然而，由于胚胎和幼虫的尾鳍太小而脆弱，因此很难将它们活下来。为了克服这个问题，基因分型的一个简单和非侵入性的方法是必不可少的。因此，我们开发了一种新的方法，只需通过观察荧光就可以无创地确定每个胚胎期的基因型。我们在基因敲入实验中证实了该方法的益处，该实验针对在受精后4天（dpf）（Murakami）在中枢神经系统（CNS）中表达的生长相关蛋白43（ gap43 et al 。，2017）。这个基因适用于基因敲入实验，因为在先前的研究中，已经通过RT-PCR和原位杂交揭示了其时空表达模式（Fujimori等， 。，2008）。如果野生型靶基因的表达模式是未知的，则需要通过RT-PCR或任何其他技术来分析，以证实其与基因敲入菌株中报道基因的对应性。
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