| High-throughput Flow Cytometry Assay to Investigate TDP43 Splicing Function
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Mutations in RNA-binding proteins (RBPs) such as TDP43 are associated with transcriptome-wide splicing defects and cause severe neurodegenerative diseases, including amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). The impact of RBP mutations on splicing function is routinely studied using PCR-based bulk measurements. However, the qualitative and low-throughput nature of this assay make quantitative and systematic analyses, as well as screening approaches, difficult to implement. To overcome this hurdle, we have developed a quantitative, high-throughput flow cytometry ...
[摘要] [摘要 ] TDP43等RNA结合蛋白（RBP）突变与转录组范围的剪接缺陷相关，并引起严重的神经退行性疾病，包括肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和额颞痴呆（FTD）。RBP突变对剪接的影响通常使用基于PCR的大量测量方法来研究其功能。但是，该方法的定性和低通量性质使得难以进行定量和系统的分析以及筛选方法。为克服这一障碍，我们开发了定量，高通量流式细胞仪检测单细胞水平的TDP43剪接功能
[背景 ] RNA结合蛋白（RBPs）（例如TDP43）通过协调RNA的稳定性，转运和加工（包括mRNA剪接）来调节转录后基因的调控（Gerstberger 等，2014）。突变和/导致RBP功能受损或聚集与许多神经退行性疾病的病因有关，例如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和额颞痴呆（FTD）（Harrison and Shorter，2017）。值得注意的是，与RBPs相关的ALS相关突变如TDP43可以引起转录组范围的剪接。缺陷，提示RBP剪接功能的失调可能是疾病的关键驱动因素（Arnold 等，2013; Sun 等，2015）。因此，ALS研究的一个重要目标是揭示RBP功能的分子机制，需要实验方法来系统询问RBP剪接功能。
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| Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay: a Simple and Versatile Method for Visual Detection of Protein-protein Interactions
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] The visible immunoprecipitation (VIP) assay is a convenient alternative to conventional co-immunoprecipitation (Katoh et al., 2015). By processing lysates from cells co-expressing GFP-fusion and RFP-fusion proteins for immunoprecipitation with GST-tagged anti-GFP Nanobody and glutathione-Sepharose beads, protein-protein interactions can be visualized by directly observing the beads bearing immunoprecipitates under a fluorescence microscope. This assay can examine a large number of protein combinations at one time, without requiring time-consuming procedures, including SDS-PAGE and ...
[摘要] 可见的免疫沉淀（VIP）测定是常规免疫共沉淀的方便的替代方法（Katoh等人，2015）。通过处理来自共表达GFP融合蛋白和RFP融合蛋白的细胞的裂解物以用GST标记的抗GFP纳米抗体和谷胱甘肽琼脂糖珠粒进行免疫沉淀，可以通过在荧光显微镜下直接观察带有免疫沉淀物的珠来显现蛋白质 - 蛋白质相互作用。该检测方法可以一次检测大量的蛋白质组合，无需耗时的操作，包括SDS-PAGE和免疫印迹。此外，VIP测定可以检查复杂的一对多和多对多的蛋白质相互作用。 VIP测定的另一个重要的点是使用纳米抗体进行免疫沉淀。纳米抗体是来自骆驼科（骆驼和亲戚）的单域抗体。由于其体积小，高亲和力，高特异性和稳定性，因此在E中表达的抗GFP纳米抗体。大肠杆菌可以大规模纯化，并且实际上用于免疫沉淀实验。在这里，我们描述了制备GST标记的抗GFP纳米抗体和VIP测定的方案。
【背景】细胞中的几乎所有蛋白质都通过与其他蛋白质相互作用起作用。揭示蛋白质 - 蛋白质相互作用网络是了解蛋白质功能的关键。已经开发了多种方法，例如酵母双杂交系统，GST pull-down和免疫共沉淀来分析蛋白质 - 蛋白质相互作用。最近，我们开发了一种称为可见免疫沉淀（VIP）测定的蛋白质 - 蛋白质相互作用分析的新方法（Katoh等人，2015）。 ...
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