| Delivery of the Cas9 or TevCas9 System into Phaeodactylum tricornutum via Conjugation of Plasmids from a Bacterial Donor
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Diatoms are an ecologically important group of eukaryotic microalgae with properties that make them attractive for biotechnological applications such as biofuels, foods, cosmetics and pharmaceuticals. Phaeodactylum tricornutum is a model diatom with defined culture conditions, but routine genetic manipulations are hindered by a lack of simple and robust genetic tools. One obstacle to efficient engineering of P. tricornutum is that the current selection methods for P. tricornutum transformants depend on the use of a limited number of antibiotic resistance genes. An ...
[摘要] 硅藻是一种具有重要生态意义的真核微藻类，其特性使其对生物燃料，食品，化妆品和药品等生物技术应用具有吸引力。 Phaeodactylum tricornutum 是具有确定培养条件的模型硅藻，但缺乏简单而强大的遗传工具阻碍了常规遗传操作。有效设计 P的一个障碍。 tricornutum 是 P的当前选择方法。 tricornutum 转化体依赖于使用有限数量的抗生素抗性基因。另一种更具成本效益的选择方法是产生 P的营养缺陷型菌株。通过敲除参与氨基酸生物合成的关键基因，并使用基于质粒的生物合成基因拷贝作为选择标记，使三角酵母。以前关于 P基因敲除的研究。 tricornutum 使用biolistic转换将CRISPR-Cas9系统传递到 P.藻。非复制质粒的生物射弹转化可导致对 P的不期望的损伤。由于转化的DNA随机整合到基因组中，tricornutum 。随后固化编辑的细胞以防止Cas9的长期过表达是非常困难的，因为目前没有方法来切除整合的质粒。该协议采用新方法将Cas9或TevCas9系统传送到 P. tricornutum 通过来自细菌供体细胞的质粒的缀合。该过程涉及：1）设计和插入靶向 P的guideRNA。将tricornutum 尿素酶基因导入TevCas9表达质粒，该质粒也编码转移的接合起点，2）将该质粒安装在含有含有接合机制的质粒（pTA-Mob）的大肠杆菌中， ...
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| Targeted Genome Editing of Virulent Phages Using CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol describes a straightforward method to generate specific mutations in the genome of strictly lytic phages. Briefly, a targeting CRISPR-Cas9 system and a repair template suited for homologous recombination are provided inside a bacterial host, here the Gram-positive model Lactococcus lactis MG1363. The CRISPR-Cas9 system is programmed to cleave a specific region present on the genome of the invading phage, but absent from the recombination template. The system either triggers the recombination event or exerts the selective pressure required to isolate recombinant phages. ...
[摘要] 该协议描述了一个直接的方法来产生严格裂解噬菌体的基因组中的特定突变。 简而言之，在细菌宿主（此处为革兰氏阳性模型乳酸乳球菌MG1363）内提供靶向CRISPR-Cas9系统和适合于同源重组的修复模板。 CRISPR-Cas9系统被编程为切割入侵噬菌体的基因组上存在的特定区域，但是缺少重组模板。 该系统触发重组事件或施加分离重组噬菌体所需的选择性压力。 利用这种方法，我们在毒性乳酸球菌噬菌体p2的基因组中产生了多个基因敲除，点突变和插入。 考虑到本协议中使用的质粒的广泛宿主范围，后者可以外推到其他噬菌体 - 宿主对。
【背景】噬菌体是在每个生态系统中发现丰富的细菌病毒（Suttle，2005; Breitbart and Rohwer，2005），毫不奇怪，它们是牛奶的天然居民。噬菌体p2是乳品工业中发现的强毒乳球菌噬菌体的最普遍组（ Sk1virus ）的模型（Deveau等人，2006; Mahony等人。，2012），它感染革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌MG1363，也是基础研究的模式菌株。尽管p2作为参照噬菌体的地位，但几乎一半的基因编码未表征的蛋白质。同样，由宏基因组学确定的绝大多数噬菌体基因在公共数据库中没有功能分配和同系物（Hurwitz等人，2016; Paez-Espino等人， 2016）。
研究基因的方法之一是通过修饰和随后观察所得到的表型。噬菌体基因组只能在宿主内以其生物活性形式进行修饰。强毒噬菌体严格裂解;因此，它们的基因组从未整合到细菌染色体中。这为DNA的体内修饰增加了一个时间限制，只能在短的感染周期内对其进行操作。 ...
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