| Investigating Neural Stem Cell and Glioma Stem Cell Self-renewal Potential Using Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA)
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Glioma stem cells (GSC) grown as neurospheres exhibit similar characteristics to neural stem cells (NSC) grown as neurospheres, including the ability to self-renew and differentiate. GSCs are thought to play a role in cancer initiation and progression. Self-renewal potential of GSCs is thought to reflect many characteristics associated with malignancy, including tumor recurrence following cytotoxic therapy due to their proliferative dormancy and capacity to allow for the development of resistant tumor cell sub-clones due to mutations acquired during their differentiation. Here, we demonstrate ...
[摘要] 作为神经球生长的神经胶质干细胞（GSC）表现出与作为神经球生长的神经干细胞（NSC）相似的特征，包括自我更新和分化的能力。 GSC被认为在癌症的发生和发展中起作用。 GSC的自我更新潜力被认为反映了与恶性肿瘤相关的许多特征，包括细胞毒性治疗后的肿瘤复发，这是由于它们的增殖性休眠和由于在其分化期间获得的突变而允许产生抗性肿瘤细胞亚克隆的能力。在这里，我们证明使用极限稀释分析（ELDA），可以测量PI3K-突变致癌NSCs和非致癌NSCs之间的球形成潜力频率的细微差异体外。我们进一步展示了ELDA如何在强制分化之前和之后用于细胞，以放大突变体和对照NSCs之间的球形成潜力的固有差异。最终，ELDA利用单个或少数种子干细胞自我更新，分裂和形成神经球的能力差异。重要的是，该测定还允许在不同条件下在遗传上不同的细胞之间或相同细胞之间进行比较，其中可以测试靶特异性药物或其他新型癌症干细胞疗法的影响。
【背景】胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的脑癌之一，预后极差（Kaye和Morokoff，2014）。 ...
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| Organotypic Explants of the Embryonic Rodent Hippocampus: An Accessible System for Transgenesis
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] This protocol describes the technique of ex-vivo electroporation to target embryonic hippocampal progenitors in an organotypic slice preparation. This technique allows gene perturbation for examining developmental processes in the embryonic hippocampus while retaining the environment and connectivity of the cells. Gene perturbation can include Cre-mediated recombination, RNAi-mediated knockdown, gene overexpression, or a combination of any of these. Ex-vivo electroporation can be performed at a wide range of embryonic stages, giving temporal control to the experimenter. ...
[摘要] 该协议描述了在器官切片制备中靶向胚胎海马祖细胞的体外电穿孔技术。 该技术允许基因摄动检查胚胎海马体的发育过程，同时保持细胞的环境和连接性。 基因扰动可以包括Cre介导的重组，RNAi介导的敲低，基因过表达或这些中任何的组合。 可以在广泛的胚胎阶段进行体外电穿孔，为实验者提供时间控制。 空间控制可以通过在皮氏培养皿中准备大脑来瞄准海马的特定区域来实现。 电穿孔的外植体培养物提供了用于研究包括祖细胞增殖，迁移和细胞命运获取在内的发育过程的高度易处理的系统。
【背景】由于其位于尾端的端脑，海马在可达性方面提出了挑战。胚胎海马甚至更难以接近，需要用子宫外科手术方法进行实验操作。器官切片文化规避了这个问题，同时保留了海马场细胞构筑学的许多方面，包括分子特征和连接性。尽管有描述来自啮齿类动物大脑的海马外植体产后培养的规程（Stoppini等人，1991; ...
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| Tracking Endocytosis and Intracellular Trafficking of Epitope-tagged Syntaxin 3 by Antibody Feeding in Live, Polarized MDCK Cells
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] The uptake and trafficking of cell surface receptors can be monitored by a technique called ‘antibody-feeding’ which uses an externally applied antibody to label the receptor on the surface of cultured, live cells. Here, we adapt the traditional antibody-feeding experiment to polarized epithelial cells (Madin-Darby Canine Kidney) grown on permeable Transwell supports. By adding two tandem extracellular Myc epitope tags to the C-terminus of the SNARE protein syntaxin 3 (Stx3), we provided a site where an antibody could bind, allowing us to perform antibody-feeding experiments on cells with ...
[摘要] 细胞表面受体的摄取和贩卖可以通过被称为“抗体 - 进纸”技术，其在外部使用上应用的抗体来标记培养的活细胞的表面上的受体进行监测。在这里，我们适应传统的抗体喂养实验极化上皮细胞（Madin-Darby犬肾）生长在透性transwell支持。通过添加两个串联胞外Myc表位标签的SNARE蛋白突触3（Stx3）的C末端，我们提供了一种站点，其中与抗体可以结合，使我们能够用不同的顶端和基底外侧膜对细胞进行抗体 - 喂养实验。通过这个程序，我们观察到Stx3的内吞和细胞内运输。具体而言，我们评估从基底外侧膜Stx3的内在化速率和在时间和空间上使用固定在不同时间点的细胞免疫荧光显微镜随后的内吞观察路径。为此，介绍了以下可追踪单层的贩运行为：来自限制膜的靶蛋白。
【背景】SNARE蛋白突触3（Stx3）是已知的建立在极化上皮细胞顶端 - 基底极性（低等人，1996年Delgrossi 等人，1997年Weimbs 等人，1997;低等人，1998;黎等人，2002;低等人
一个典型的12孔细胞培养皿的阱内的transwell小室的聚碳酸酯膜的细胞培养插入物的图1示意图。斯特朗细胞是在膜的顶部和培养将形成紧密的单层做密封关聚碳酸酯膜将顶端介质隔室与基底外侧介质隔室分开。 ...
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