| Ciliary Assembly/Disassembly Assay in Non-transformed Cell Lines
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The primary cilium is a non-motile sensory organelle whose assembly and disassembly are closely associated with cell cycle progression. The primary cilium is elongated from the basal body in quiescent cells and is resorbed as the cells re-enter the cell cycle. Dysregulation of ciliary dynamics has been linked with ciliopathies and other human diseases. The in vitro serum-stimulated ciliary assembly/disassembly assay has gained popularity in addressing the functions of the protein-of-interest in ciliary dynamics. Here, we describe a well-tested protocol for transfecting human retinal ...
[摘要] 主要纤毛是一种非运动感觉细胞器，其装配和拆卸与细胞周期进程密切相关。 初级纤毛在静止细胞中从基体拉长并随着细胞重新进入细胞周期而被吸收。 睫状动力失调与纤毛病和其他人类疾病有关。 体外血清刺激的睫状体装配/分解测定已经在解决睫状动力学中感兴趣的蛋白质的功能方面受到欢迎。 在这里，我们描述了转染人视网膜色素上皮细胞（RPE-1）和对转染细胞进行睫状体装配/分解测定的充分测试的方案。
【背景】初级纤毛是毛发样感觉细胞器，其在G 0 / G 1期出现，并且在细胞周期的S期之前分解（Tucker等， et al。，1979）。先前的研究已经证实，某些未转化的细胞类型（即，甚至是RPE-1细胞，3T3成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞[MEFs]）可以被饿死以诱导静止和睫状体形成。随后的血清再次添加触发双相睫状体吸收，其在刺激后2小时和24小时达到峰值（Tucker等人，1979; Li等人，2011） 。该现象为文献中常用的血清刺激的睫状体组装/分解测定奠定了基础，以鉴定参与睫状体组装和拆卸的蛋白质（Pugacheva等人，2007; ...
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| Investigating Localization of Chimeric Transporter Proteins within Chloroplasts of Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] In this protocol, we describe a method to design chimeric proteins for specific targeting to the inner envelope membrane (IEM) of Arabidopsis chloroplasts and the confirmation of their localization by biochemical analysis. Specific targeting to the chloroplast IEM can be achieved by fusing the protein of interest with a transit peptide and an IEM targeting signal. This protocol makes it possible to investigate the localization of chimeric proteins in chloroplasts using a small number of transgenic plants by using a modified method of chloroplast isolation and fractionation. IEM ...
[摘要] 在这个协议中，我们描述了一种设计嵌合蛋白的方法，用于特异性靶向拟南芥叶绿体的内包膜（IEM）并通过生化分析确定它们的定位。 叶绿体IEM的特异性靶向可通过将感兴趣的蛋白质与转运肽和IEM靶向信号融合来实现。 这个协议使得有可能使用少量的转基因植物，通过使用修改的叶绿体分离和分离方法来研究嵌合蛋白在叶绿体中的定位。 嵌合蛋白的IEM定位可以通过胰蛋白酶消化和碱性提取进一步评估。 在此，称为SbtAII的嵌合碳酸氢根转运蛋白的定位通过使用针对葡萄球菌蛋白A的抗体进行蛋白质印迹来检测。该方案改编自上原等人，2016年
【背景】有人提出将蓝藻CO 2浓度机制整合到叶绿体中是改善C 3+植物光合作用的有希望的方法。 根据理论估计，将BicA和SbtA整合到叶绿体IEM中可以提高光合CO 2固定率。 我们研究了核编码的蓝细菌碳酸氢盐转运蛋白BicA和SbtA与拟南芥叶绿体的IEM的整合。 因此，我们制定了一个协议，设计嵌合构造为特定目标的IEM和调查嵌合蛋白在叶绿体中的定位。
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| In vitro RNA-dependent RNA Polymerase Assay Using Arabidopsis RDR6
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) in eukaryotes convert single-stranded RNAs into double-stranded RNAs, thereby amplifying small interfering RNAs that play crucial roles in the regulation of development, maintenance of genome integrity and antiviral immunity. Here, we describe a method of in vitro RdRP assay using recombinant Arabidopsis RDR6 prepared by an insect expression system. By using this classical biochemical assay, we revealed that RDR6 has a strong template preference for RNAs lacking a poly(A) tail. This simple method will be applicable to other RdRPs in Arabidopsis ...
[摘要] 真核生物中的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）将单链RNA转化为双链RNA，从而扩增在调节发育，维持基因组完整性和抗病毒免疫方面起关键作用的小干扰RNA。 在此，我们描述了使用通过昆虫表达系统制备的重组拟南芥RDR6的体外RdRP测定的方法。 通过使用这种经典的生物化学分析，我们发现RDR6有一个强大的模板偏好RNAs缺乏poly（A）尾巴。 这个简单的方法将适用于拟南芥属和其他生物体中的其他RdRPs。
【背景】已经在所有真核生物王国 - 植物，真菌，原生动物和动物中发现RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）基因（Zong等人，2009）。它们将单链RNA（ssRNA）转化为双链RNA（dsRNA），从而扩增在各种生物过程中发挥关键作用的小干扰RNA（siRNA），包括调节发育（Peragine等人， ，2004; Li等人，2005），维持基因组完整性（Volpe等人，2002; Xie等人，2004年， ）和抗病毒免疫性（Mourrain等人，2000; Yu等人，2003; Garcia-Ruiz等人，2010; Wang ，2010）。除了这种RdRP活性之外，RdRP还具有称为末端核苷酸转移酶（TNTase）活性的另一种酶活性（Curaba和Chen，2008; ...
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