| Resolving Structural Changes of Photoreceptors in Living Escherichia coli via In-cell Infrared Difference Spectroscopy
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Several in-cell spectroscopic techniques have been developed recently to investigate the structure and mechanism of proteins in their native environment. Conditions in vivo differ dramatically from those selected for in vitro experiments. Accordingly, the cellular environment can affect the protein mechanism for example by molecular crowding or binding of small molecules. Fourier transform infrared (FTIR) difference spectroscopy is a well-suited method to study the light-induced structural responses of photoreceptors including changes in cofactor, side chains and secondary structure. Here, we ...
[摘要] [摘要]最近开发了几种细胞内光谱技术，以研究蛋白质在其天然环境中的结构和机理。体内条件与为体外实验选择的条件大不相同。因此，细胞环境可例如通过分子拥挤或小分子结合来影响蛋白质机制。傅立叶TRANSF ORM红外（FTIR）光谱差异是非常适合的方法来研究的光诱导结构响应小号光感受器，包括辅因子的变化，侧链和二级结构。在这里，我们描述了一种协议，用于研究活大肠杆菌中辅因子和蛋白质的响应 通过使用衰减全反射（ATR）配置的细胞内红外差（ICIRD）光谱分析细胞。蛋白质在大肠杆菌中过表达，将细胞转移到盐溶液中，并使用荧光光谱法确定每个细胞的拷贝数。将悬浮液离心，并将浓缩的细胞转移到FTIR光谱仪内的ATR池中。该恒温细胞密封并从与LED的顶部照明。在照射之前和之后记录强度光谱，以产生活细胞内部受体的差异光谱。利用ICIRD光谱，可在近乎自然的环境中解决可溶性感光体的结构变化。该方法在环境条件下可在H 2 O中运行，无标记，对蛋白质大小没有任何限制，并且不需要任何纯化步骤。
图形摘要：
使用衰减全反射对活大肠杆菌中的感光细胞进行细胞内红外差异光谱分析。
[背景]光感受器在从细菌，真菌，藻类和植物到动物的各种生物体的光感测和光适应中起着至关重要的作用（Möglich等，2010 ; ...
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| Detection of Protein Interactions in the Cytoplasm and Periplasm of Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] This protocol was developed to qualitatively and quantitatively detect protein-protein interactions in Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer (FRET). The described assay allows for the previously impossible in vivo screening of periplasmic protein-protein interactions. In FRET, excitation of a donor fluorescent molecule results in the transfer of energy to an acceptor fluorescent molecule, which will then emit light if the distance between them is within the 1-10 nm range. Fluorescent proteins can be genetically encoded as fusions to proteins of interest and ...
[摘要] 该协议的开发是通过Förster共振能量转移（FRET）定性和定量检测大肠杆菌中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。所描述的测定允许以前不可能的周质蛋白质 - 蛋白质相互作用的体内筛选。在FRET中，供体荧光分子的激发导致能量转移到受体荧光分子，如果它们之间的距离在1-10nm范围内，则受体荧光分子将发光。荧光蛋白质可以被遗传编码为与感兴趣的蛋白质的融合物并且在细胞中表达，因此FRET蛋白质 - 蛋白质相互作用实验可以在体内进行。供体和受体荧光蛋白融合体被构建用于被怀疑相互作用的细菌蛋白质。这些融合蛋白在细菌细胞中共表达，随后激发供体和受体通道测量荧光发射光谱。供体的发射光谱与受体的激发光谱之间的部分重叠是FRET的先决条件。即使在没有FRET的情况下，供体激发也可以使受体以已知百分比交叉激发。通过测量背景，仅供体和仅受体样品的参考光谱，可以计算预期的发射光谱。在预期光谱之上的受体的致敏发射可以归因于FRET，并且可以通过光谱解混来量化。
【背景】确定如何和哪些蛋白质相互作用维持生命是分子生物学研究的核心。存在许多体外方法，但可能导致误报，因为相互作用是从其生物学背景中取出的。 ...
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