| Pancreatic Acinar Cell Preparation for Oxygen Consumption and Lactate Production Analysis
|
|
Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] Mitochondrial dysfunction is a principal feature of acute pancreatitis (AP) although the underlying mechanisms are still unclear. AP precipitants induce Ca2+-dependent formation of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP) in pancreatic acinar cells (PACs), leading to ATP depletion and necrosis. Evaluations of mitochondrial bioenergetics have mainly been performed in isolated PACs using confocal microscopy, with assessment of mitochondrial membrane potential, NADH/FAD+ and ATP levels, coupled with patch-clamp electrophysiology. These studies are technically ...
[摘要] [摘要 ] 线粒体功能障碍是急性胰腺炎（AP）的主要特征，尽管其潜在机制尚不清楚。AP沉淀剂诱导胰腺腺泡细胞（PACs）中线粒体通透性过渡孔（MPTP）的Ca 2+ 依赖性形成，导致ATP耗竭和坏死。线粒体生物能学的评估主要使用共聚焦显微镜在分离的PAC中进行，评估线粒体膜电位，NADH / FAD + 和ATP水平，以及膜片钳电生理学。这些研究在技术上既费时又费力。应用范围 海马通量分析现在允许使用多孔平板阅读器格式对细胞群体中的生物能学变化进行详细研究；耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）分别提供有关细胞呼吸和糖酵解的重要信息。诸如最大呼吸，ATP关联容量和质子泄漏等参数可以通过应用呼吸功能“压力”测试得出，该测试涉及电子传输链的药理处理。因此，使用Seahorse Flux分析提供了一种快速，方便的方法来测量详细的细胞生物能学，并使结果与其他基于平板读取器的测定法结合使用，从而更全面地了解线粒体生物能学改变的病理生理后果。
[背景 ] 线粒体功能障碍是急性胰腺炎（AP）的核心特征，急性胰腺炎是一种使人衰弱且可能致命的疾病，目前尚无针对性的治疗方法（Criddle，2016； Habtezion ...
|
|
|
| Characterising Maturation of GFP and mCherry of Genomically Integrated Fusions in Saccharomyces cerevisiae
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Single-molecule fluorescence microscopy enables unrivaled sub-cellular quantitation of genomically encoded fusions of native proteins with fluorescent protein reporters. Fluorescent proteins must undergo in vivo maturation after expression before they become photoactive. Maturation effects must be quantified during single-molecule analysis. Here we present a method to characterise maturation of GFP and mCherry genetic protein fusions in budding yeast Saccharomyces cerevisiae.
[摘要] 单分子荧光显微镜技术使天然蛋白与荧光蛋白报告基因的基因组编码融合成为无与伦比的亚细胞定量。 荧光蛋白质在表达后必须进行体内成熟，然后它们变成光敏的。 成熟效应必须在单分子分析过程中进行量化。 在这里，我们提出一种方法来表征GFP和mCherry遗传蛋白融合在芽殖酵母酿酒酵母中的成熟。
【背景】单分子荧光显微技术能够灵敏定量分子化学计量，流动性和拷贝数，不仅在逐个细胞的基础上，而且精确到个别的亚细胞区室（Leake，2012; Wollman和Leake，2015; Shashkova， >等。，2017）。该技术依赖于感兴趣的野生型蛋白质的内源表达的荧光蛋白融合，从而存在一对一的标记。然而，所有荧光蛋白在进入明亮的荧光状态之前的体内成熟时间从几分钟到几十分钟不等（Badrinarayanan等人，2012）。因此，测量任何成熟效应和量化是否存在标记蛋白质的不成熟“暗部分”是最重要的。这些测量也与光漂白（FRAP）后的荧光恢复特别相关。 FRAP可用于研究活细胞中的分子转换（Beattie等人，2017）。 FRAP基于荧光标记组分定位的细胞区域的光漂白，随后定量该区域随时间的任何荧光恢复。可以使用在初始光漂白剂之后作为时间函数的荧光强度之间的测量关系来确定分子迁移率和动力学参数，例如特定荧光组分从分子复合物解离的速率（Leake等人， ...
|
|
|