Separation of Thylakoid Protein Complexes with Two-dimensional Native-PAGE
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] The hierarchical composition and interactions of the labile thylakoid protein complexes can be assessed by sequential 2D-native gel-electrophoresis system. Mild non-ionic detergent digitonin is used to solubilize labile protein super-and megacomplexes, which are then separated with first-dimension blue native polyacrylamide gel electrophoresis (1D-BN-PAGE). The digitonin derived protein complexes are further solubilized with stronger detergent, β-DM, and subsequently separated on an orthogonal 2D-BN-PAGE to release smaller protein subcomplexes from the higher-order supercomplexes. Here we ...
[摘要] 不稳定的类囊体蛋白复合物的分级组成和相互作用可以通过连续的2D天然凝胶电泳系统来评估。 温和的非离子洗涤剂洋地黄皂苷用于溶解不稳定的蛋白质超级和巨型复合物,然后用第一维蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D-BN-PAGE)分离。 将洋地黄皂苷衍生的蛋白质复合物用更强的去污剂β-DM进一步溶解,随后在正交的2D-BN-PAGE上分离,以从较高级的超复合物中释放较小的蛋白质亚复合物。 在这里,我们描述了来自拟南芥的类囊体蛋白复合物的2D-BN-PAGE分析的详细方法。
【背景】在类囊体膜中发生光合作用的光反应,在高等植物中,由贴壁的grana类囊体和非贴壁的基质类囊体组成。光反应由多亚基蛋白复合物光系统(PS)I和II,细胞色素b 6 f和ATP酶催化。 PSII及其光捕获天线复合物(LHCII)在grana-thylakoids中最为丰富,因此在空间上与基质类囊体定位的PSI-LHCI复合物隔离(Andersson和Anderson,1980)。格拉纳和基质类囊体之间的间期在两个光系统中都得到了丰富(Albertsson,2001; Suorsa et al。,2015)。通过光依赖性LHCII和PSII蛋白的可逆磷酸化介导,光系统与LHCII一起组装成更大的超级和超级复合物。 ...
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Measuring Nucleosome Assembly Activity in vitro with the Nucleosome Assembly and Quantification (NAQ) Assay
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Nucleosomes organize the eukaryotic genome into chromatin. In cells, nucleosome assembly relies on the activity of histone chaperones, proteins with high binding affinity to histones. At least a subset of histone chaperones promotes histone deposition in vivo. However, it has been challenging to characterize this activity, due to the lack of quantitative assays.
Here we developed a quantitative nucleosome assembly (NAQ) assay to measure the amount of nucleosome formation in vitro. This assay relies on a Micrococcal nuclease (MNase) digestion step that yields ...
[摘要] 核小体将真核生物基因组组装成染色质。在细胞中,核小体装配依赖于组蛋白分子伴侣的活性,对组蛋白具有高结合亲和力的蛋白。至少有一部分组蛋白伴侣促进组蛋白在体内的沉积。然而,由于缺乏定量分析,鉴定这种活性一直是一个挑战。
在这里,我们开发了一种定量核小体装配(NAQ)测定来测量体外核小体形成的量。该测定依赖于微球菌核酸酶(MNase)。随后在生物分析仪上运行,可以准确量化相对于加样对照的片段(长度和数量)。这使我们能够测量约150bp的DNA长度。该测定最终实现了不同组蛋白分子伴侣的核小体装配活性的表征,这是理解这些蛋白体内功能作用的一个步骤。
【背景】真核生物基因组被组织成核小体。核小体是由组蛋白八聚体核心组成的模块化和动态结构,由147bp的DNA包裹(Luger等人,1997)。核小体组装始于一个(H3-H4)2四聚体沉积到DNA上以形成四体体。随后的H2A-H2B二聚体结合形成六聚体,最后形成核小体。组蛋白高度带电,因为它们以生理盐浓度存在于组蛋白二聚体中。由于它们的作用,组蛋白需要分子伴侣将它们从细胞质穿梭到细胞核,然后辅助它们沉积到DNA上或从DNA上去除(Gurard-Levin等人,2014)。
组蛋白分子伴侣分组在结构上不相关的蛋白质家族中,所有这些蛋白质的特征在于对组蛋白的高度结合亲和力(Laskey等,1978)。通过这种方式,他们屏蔽了组蛋白的电荷,阻止了与DNA和其他细胞因子的非特异性相互作用(Elsässerand ...
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