| FRET-based Stoichiometry Measurements of Protein Complexes in vitro
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] For a complete understanding of biochemical reactions, information on complex stoichiometry is essential. However, measuring stoichiometry is experimentally challenging. Our lab has developed a FRET-based assay to study protein complex stoichiometry in vitro. This assay, also known as Job plot, is set up as a continuous variation of the molar ratio between the two species, kept at constant total concentration. The FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) between the two fluorescently-labeled proteins is measured and the stoichiometry is inferred from the sample with highest FRET ...
[摘要] 为了全面了解生化反应，复杂的化学计量学信息是必不可少的。 然而，测量化学计量学在实验上是具有挑战性的。 我们的实验室已经开发了基于FRET的测定法来研究蛋白质复合体化学计量体外。 该测定法也被称为作业区，其被设定为两种物质之间的摩尔比的连续变化，保持恒定的总浓度。 测量两种荧光标记蛋白之间的FRET（荧光共振能量转移），并从具有最高FRET信号的样品中推断化学计量。 这种方法使我们能够评估溶液中复杂的化学计量。
【背景】每个生物化学反应需要两种或更多种细胞组分之间的相互作用。这些相互作用的化学计量是调节细胞生物化学反应的重要因素。因此，复杂化学计量的实验确定对于充分了解细胞内工作的生物化学和生物物理学过程至关重要。
测量化学计量具有实验上的挑战性。化学计量可以通过低分辨率结构分析来推断。这些方法包括尺寸排阻色谱法，多角度光散射，分析超速离心，其能够提供粒子的精确分子量。但是，这些方法被认为是次要的。
基于FRET（荧光共振能量转移）的溶液中的化学计量。这种测定方法称为工作区（Huang，1982），可以用较少的材料进行，更适合研究任何复杂的地层，与两种成分的大小无关。在该测定中，样品保持恒定的总蛋白质浓度，但两种组分之间的摩尔比连续变化（图1）。具有复合物功能化学计量的样品希望显示最高的FRET信号。
这是获得溶液中复杂化学计量和任何大小组分之间测量的有力方法。因为FRET测量需要复合物的两个组分都被荧光标记，所以需要各种对照来排除标记过程的潜在伪影。理想的情况是单个位点的标记在该测定中是可取的（D'Arcy等人，2013; ...
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| Measuring Nucleosome Assembly Activity in vitro with the Nucleosome Assembly and Quantification (NAQ) Assay
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Nucleosomes organize the eukaryotic genome into chromatin. In cells, nucleosome assembly relies on the activity of histone chaperones, proteins with high binding affinity to histones. At least a subset of histone chaperones promotes histone deposition in vivo. However, it has been challenging to characterize this activity, due to the lack of quantitative assays.
Here we developed a quantitative nucleosome assembly (NAQ) assay to measure the amount of nucleosome formation in vitro. This assay relies on a Micrococcal nuclease (MNase) digestion step that yields ...
[摘要] 核小体将真核生物基因组组装成染色质。在细胞中，核小体装配依赖于组蛋白分子伴侣的活性，对组蛋白具有高结合亲和力的蛋白。至少有一部分组蛋白伴侣促进组蛋白在体内的沉积。然而，由于缺乏定量分析，鉴定这种活性一直是一个挑战。
在这里，我们开发了一种定量核小体装配（NAQ）测定来测量体外核小体形成的量。该测定依赖于微球菌核酸酶（MNase）。随后在生物分析仪上运行，可以准确量化相对于加样对照的片段（长度和数量）。这使我们能够测量约150bp的DNA长度。该测定最终实现了不同组蛋白分子伴侣的核小体装配活性的表征，这是理解这些蛋白体内功能作用的一个步骤。
【背景】真核生物基因组被组织成核小体。核小体是由组蛋白八聚体核心组成的模块化和动态结构，由147bp的DNA包裹（Luger等人，1997）。核小体组装始于一个（H3-H4）2四聚体沉积到DNA上以形成四体体。随后的H2A-H2B二聚体结合形成六聚体，最后形成核小体。组蛋白高度带电，因为它们以生理盐浓度存在于组蛋白二聚体中。由于它们的作用，组蛋白需要分子伴侣将它们从细胞质穿梭到细胞核，然后辅助它们沉积到DNA上或从DNA上去除（Gurard-Levin等人，2014）。
组蛋白分子伴侣分组在结构上不相关的蛋白质家族中，所有这些蛋白质的特征在于对组蛋白的高度结合亲和力（Laskey等，1978）。通过这种方式，他们屏蔽了组蛋白的电荷，阻止了与DNA和其他细胞因子的非特异性相互作用（Elsässerand ...
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