| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the ...
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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| Ciliary Assembly/Disassembly Assay in Non-transformed Cell Lines
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The primary cilium is a non-motile sensory organelle whose assembly and disassembly are closely associated with cell cycle progression. The primary cilium is elongated from the basal body in quiescent cells and is resorbed as the cells re-enter the cell cycle. Dysregulation of ciliary dynamics has been linked with ciliopathies and other human diseases. The in vitro serum-stimulated ciliary assembly/disassembly assay has gained popularity in addressing the functions of the protein-of-interest in ciliary dynamics. Here, we describe a well-tested protocol for transfecting human retinal ...
[摘要] 主要纤毛是一种非运动感觉细胞器，其装配和拆卸与细胞周期进程密切相关。 初级纤毛在静止细胞中从基体拉长并随着细胞重新进入细胞周期而被吸收。 睫状动力失调与纤毛病和其他人类疾病有关。 体外血清刺激的睫状体装配/分解测定已经在解决睫状动力学中感兴趣的蛋白质的功能方面受到欢迎。 在这里，我们描述了转染人视网膜色素上皮细胞（RPE-1）和对转染细胞进行睫状体装配/分解测定的充分测试的方案。
【背景】初级纤毛是毛发样感觉细胞器，其在G 0 / G 1期出现，并且在细胞周期的S期之前分解（Tucker等， et al。，1979）。先前的研究已经证实，某些未转化的细胞类型（即，甚至是RPE-1细胞，3T3成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞[MEFs]）可以被饿死以诱导静止和睫状体形成。随后的血清再次添加触发双相睫状体吸收，其在刺激后2小时和24小时达到峰值（Tucker等人，1979; Li等人，2011） 。该现象为文献中常用的血清刺激的睫状体组装/分解测定奠定了基础，以鉴定参与睫状体组装和拆卸的蛋白质（Pugacheva等人，2007; ...
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