| Isolation and High Throughput Flow Cytometric Apoptosis Assay of Human Neutrophils to Enable Compound Library Screening
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] The study of human neutrophils in vitro is challenging due to their short half-life and propensity for activation. However, with careful handling and manipulation in the laboratory, they can be a powerful tool to investigate immune responses in health and disease. Here we describe a method for the isolation of human neutrophils from peripheral blood samples, followed by a high-throughput screen to assess the efficacy of a library of compounds in inducing neutrophil apoptosis, which may have therapeutic potential in neutrophil-driven diseases. This protocol is based on ...
[摘要] [摘要] 人类嗜中性粒细胞的研究 由于其半衰期短且易于活化，因此体外具有挑战性，然而，通过在实验室中的仔细处理和操纵，它们可以成为研究健康和疾病中免疫反应的有力工具。在此，我们介绍了一种分离方法外周血样本中的人类嗜中性粒细胞，然后进行高通量筛选，以评估化合物库诱导嗜中性粒细胞凋亡的功效，该化合物在嗜中性粒细胞驱动的疾病中可能具有治疗潜力。此规程基于先前发表的嗜中性粒细胞分离方法利用红细胞的葡聚糖沉降，接着用等离子体/粒细胞的分离的Percoll 〜1×10个的不连续梯度centrifugation.Yields 6 每嗜中性粒细胞毫升的血液，和>的纯度95个％嗜中性粒细胞是典型的。嗜中性粒细胞与经处理的激酶抑制剂文库，然后通过流式细胞仪评估中性粒细胞凋亡的速率。低通量用于高通量筛选人类原代免疫细胞，以鉴定具有修饰嗜中性粒细胞功能的化合物，并可根据需要进行修饰以评估其他表型。
[背景] 中性粒细胞是重要的先天免疫细胞与键的角色防御抵抗infection.They是短暂的细胞中，在感染和inflammat部位延长6-8小时循环典型的半衰期离子（萨默斯等人。 。，2010 ; Hidalgo。Et Al ...
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| RNA Purification from the Unicellular Green Alga, Chromochloris zofingiensis
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Chromochloris zofingiensis is a unicellular green alga that is an emerging model species for studies in fields such as biofuel production, ketocarotenoid biosynthesis and metabolism. The recent availability of a high-quality genome assembly facilitates systems-level analysis, such as RNA-Seq. However, cells of this alga have a tough cell wall, which is a challenge for RNA purification. This protocol was designed specifically to breach the cell wall and isolate high-quality RNA suitable for RNA-Seq studies.
[摘要] Chromochloris zofingiensis 是一种单细胞绿藻，是生物燃料生产，酮类胡萝卜素生物合成和代谢等领域研究的新兴模式物种。 最近获得的高质量基因组组装便于系统级分析，如RNA-Seq。 然而，这种藻类的细胞具有坚韧的细胞壁，这对于RNA纯化来说是一个挑战。 该方案专门设计用于破坏细胞壁并分离适合RNA-Seq研究的高质量RNA。
【背景】Chromochloris zofingiensis 是一种来自叶绿体谱系的小型单细胞绿藻（Dönz，1934）。此前，该物种在文献中已被描述为属于Muriella ，小球藻和 Mychonastes （Fučíková和Lewis，2012）。 C中有强烈的经济利益。因为它能够生产大量用于生物燃料的脂质，并且显示有望成为具有商业价值的营养制品虾青素的来源（Breuer等人，2012; Mulders等人。，2014; Liu et。，2016）。最近，发布了高质量的染色体水平的基因组组装和附带的注释，这有助于系统水平分析，如RNA-Seq（Roth等人，2017）。以下方案被设计为从液体培养物中产生高度纯化的总RNA，包括miRNA。 zofingiensis 适合RNA-Seq。 ℃。 zofingiensis 细胞受坚固细胞壁的保护，该细胞壁被设计为穿透。该方案的起始材料可以高达2.5×10 ...
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| CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and ...
[摘要] 定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法，使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时，这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用，它适用于可溶性和不可溶性成分，包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心，其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。
【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上，通过免疫共沉淀（共-IP）和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而，一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解，下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得，这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物，邻近依赖性生物素鉴定（BioID）提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”（Roux等人，2012年）。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶（BirA）。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体（Roux et al。，2012; Van Itallie et al。，2013） ...
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