| Measurement of Protein-Protein Interactions through Microscale Thermophoresis (MST)
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] The binding interactions of PD-1 and PD-L1 have been studied by surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC) over the past few years, but these investigations resulted in controversy regarding the values of the dissociation constant (Kd) (Freeman et al., 2000). MST is a powerful new method for the quantitative analysis of protein-protein interactions (PPIs) with low sample consumption. The technique is based on the movement of molecules along microscopic temperature gradients, and it detects changes in their hydration shell, charge or size. ...
[摘要] [摘要 ] 近年来，通过表面等离振子共振（SPR）和等温滴定热法（ITC）研究了PD-1和PD-L1的结合相互作用，但这些研究引起了解离常数值的争议。 （ķ d ）（弗里曼等人，2000） 。MST是一种功能强大的新方法，可定量分析低样品消耗的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。该技术基于分子沿微观温度梯度的移动，并检测其水合壳，电荷或大小的变化。一个结合蛋白摹伴侣荧光拉贝领导， 而另一个绑定伙伴仍保持无标签状态。我们使用的协议允许通过MST确定结合亲和力，而无需从细胞裂解物中纯化靶蛋白。将此MST方法应用于在CHO-K1细胞中表达的PD-1-eGFP和PD-L1-eGFP的应用，首次使我们能够确定PD-1及其配体PD-L1之间形成的复合物的亲和力在肿瘤逃逸期间。该协议在研究蛋白质与小分子之间的相互作用方面具有多种潜在应用。
[背景技术 [ 0002 ] 鉴定能够调节PD-1和PD-L1之间形成的复合物的亲和力的化合物代表了针对肿瘤免疫逃逸的新疗法的开发的重大进展。该方案涉及eGFP 融合蛋白的过表达，然后从细胞裂解物中提取eGFP 融合蛋白，无需任何纯化步骤即可测定PD-1和PD-L1之间的亲和常数。因此，该协议的发展需要产生eGFP 融合蛋白。该协议旨在通过避免繁琐的纯化步骤来定量加速蛋白质相互作用的表征。该协议还可以用于通过PD-1 / ...
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| Extraction and 16S rRNA Sequence Analysis of Microbiomes Associated with Rice Roots
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Plant roots associate with a wide diversity of bacteria and archaea across the root-soil spectrum. The rhizosphere microbiota, the communities of microbes in the soil adjacent to the root, can contain up to 10 billion bacterial cells per gram of soil (Raynaud and Nunan, 2014) and can play important roles for the fitness of the host plant. Subsets of the rhizospheric microbiota can colonize the root surface (rhizoplane) and the root interior (endosphere), forming an intimate relationship with the host plant. Compositional analysis of these communities is important to develop tools in order to ...
[摘要] 植物根系与根 - 土壤谱中的各种细菌和古细菌相关联。根际微生物群落，即与根系相邻的土壤中的微生物群落，每克土壤可含有高达100亿个细菌细胞（Raynaud和Nunan，2014），并且可以在宿主植物的适应性方面发挥重要作用。根际微生物群的亚群可以在根表面（根毛菌）和根内部（内生孢子）定居，与寄主植物形成密切关系。这些群落的成分分析对于开发工具以操纵根系相关微生物群以提高作物生产力非常重要。由于降低了成本并提高了下一代测序的通量，因此主要通过使用16S rRNA基因的扩增子测序来最终破解这些群落的主要进展。在这里，我们首先提出一个协议，用于解剖来自各种根室的微生物群，这些根室是以水稻为模型开发的。接下来我们介绍一种使用双指数方法扩增16S rRNA基因片段的方法。最后，我们提供了一个简单的工作流程来分析生成的测序数据以进行生态推理。
【背景】各种植物根生态位寄主于源自土壤的不同微生物群落（微生物群落）（Bulgarelli et al。，2012; Lundberg等人，2012; Edwards等人。2015年; Zarraonaindia等人，2015年; Wagner等人，2016年）。由每个根生态位获得的不同微生物群可能具有不同的代谢潜力，因此可能以不同方式影响宿主植物的健康（Finkel等人，2017）。可以通过使用16S ...
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| CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and ...
[摘要] 定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法，使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时，这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用，它适用于可溶性和不可溶性成分，包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心，其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。
【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上，通过免疫共沉淀（共-IP）和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而，一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解，下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得，这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物，邻近依赖性生物素鉴定（BioID）提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”（Roux等人，2012年）。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶（BirA）。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体（Roux et al。，2012; Van Itallie et al。，2013） ...
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