| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the ...
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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| In vitro Nitrate Reductase Activity Assay from Arabidopsis Crude Extracts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Nitrate reductase (NR) reduces the major plant nitrogen source, NO3-, into NO2-. NR activity can be measured by its final product, nitrite through its absorbance under optimized condition. Here, we present a detailed protocol for measuring relative enzyme activity of NR from Arabidopsis crude extracts. This protocol offers simple procedure and data analysis to compare NR activity of multiple samples.
[摘要] 硝酸还原酶（NR）将主要的植物氮源NO 3 N-2还原为NO 2 - 2。 NR活性可以通过其最终产物，亚硝酸盐在最佳条件下通过其吸光度来测量。 在这里，我们提供了一个详细的协议，用于测量来自拟南芥粗提物的NR的相对酶活性。 该协议提供简单的程序和数据分析来比较多个样品的NR活性。
【背景】氮是植物所需的主要营养素，主要以硝酸盐的形式吸收。硝酸还原酶是高等植物中首次同化氮的酶。植物硝酸还原酶的同型二聚体如下催化硝酸根的NAD（P）H依赖性还原为亚硝酸根：
NO <3> + NADH + H +→NO - + NAD + H 测量NR活性的方法可能是研究影响NR活性的生物因素的有力工具（Park等人，2011）。氮同化影响植物中氨基酸的含量，因此调节NR活性可用于提高某些作物的质量（Croy和Hageman，1970; Dalling和Loyn，1977; Ruan等人，1998） ）。在该协议中，在优化的缓冲液条件下限制时间内亚硝酸盐浓度增加作为可比值获得。亚硫酸盐浓度通过Griess测定法通过其在540nm处的吸光度来测量。简言之，亚硝酸盐与磺胺酸形成重氮盐，然后N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐形成有色偶氮化合物。可以比较这些值以确定样品如何具有不同的NR活性。此外，通过简单的过程可以将这些数值转换为精确增加的亚硝酸盐浓度。 ...
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