| In vitro AMPylation/Adenylylation of Alpha-synuclein by HYPE/FICD
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] One of the major histopathological hallmarks of Parkinson’s disease are Lewy bodies (LBs) –cytoplasmic inclusions, enriched with fibrillar forms of the presynaptic protein alpha-synuclein (α-syn). Progressive deposition of α-syn into LBs is enabled by its propensity to fibrillize into insoluble aggregates. We recently described a marked reduction in α-syn fibrillation in vitro upon posttranslational modification (PTM) by the Fic (Filamentation induced by cAMP) family adenylyltransferase HYPE/FICD (Huntingtin yeast-interacting protein E/FICD). Specifically, HYPE utilizes ATP to ...
[摘要] [摘要 ] 帕金森氏病的主要组织病理学标志之一是路易体（LB） –细胞质内含物，富含纤维状形式的突触前蛋白α-突触核蛋白（α-syn）。由于α-syn易于原纤维化成不溶性聚集体，因此可以逐步沉积到LBs中。我们最近描述了Fic（由cAMP诱导的细丝化）家族腺苷酸转移酶HYPE / FICD（与亨廷顿酵母相互作用的蛋白E / FICD）在翻译后修饰（PTM）后体外α-syn纤颤的明显减少。具体而言，HYPE利用ATP在称为AMPylation 或adenylylation 的PTM中，以AMP（单磷酸腺苷）共价修饰α-syn's N末端和NAC（非淀粉样β成分）区域中的关键苏氨酸残基。HYPE底物（例如α-syn）的体外AMPyl化反应现状使用多种ATP类似物，包括放射性标记的α - 32 P-ATP 或α - 33 P-ATP，荧光ATP类似物，生物素化ATP类似物（N6- [6-六甲基] -ATP-生物素），以及基于点击化学的烷基-ATP方法检测基于凝胶的AMPylation 。当前描述HYPE介导AMPylation 的分步方案的文献依赖于α - 33 P-ATP核苷酸，而不是更常见的α - 32 P-ATP。尽管有效，但前一种方法需要长时间且危险的DMSO-PPO（二甲基亚砜- 聚苯基恶唑）沉淀。因此，我们提供了基于α - 33 ...
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| Centromere Chromosome Orientation Fluorescent in situ Hybridization (Cen-CO-FISH) Detects Sister Chromatid Exchange at the Centromere in Human Cells
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Human centromeres are composed of large tandem arrays of repetitive alpha satellite DNA, which are often sites of aberrant rearrangement in cancers (Mitelman et al., 1997; Padilla-Nash et al., 2001). To date, annotation of the human centromere repetitive sequences remains incomplete, greatly hindering in-depth functional studies of these regions essential for chromosome segregation. In order to monitor sister chromatid exchange happening at the centromere (C-SCE) due to recombination and mutagenic events, I have applied the Chromosome-Orientation Fluorescence in situ ...
[摘要] 人类着丝粒由重复的α卫星DNA的大串联阵列组成，这些细胞通常是癌症中异常重排的位点（Mitelman等人，1997; Padilla-Nash等人 >，2001）。迄今为止，对人类着丝粒重复序列的注释仍然不完整，极大地妨碍了这些区域对染色体分离至关重要的深入功能研究。为了监测由于重组和诱变事件而在着丝粒（C-SCE）上发生姊妹染色单体交换，我将染色体定位荧光原位杂交（CO-FISH）技术应用于着丝粒（ Cen-CO-FISH）在人类细胞中的表达。这种基于杂交的方法包括（1）通过单轮复制掺入核苷酸类似物，（2）新合成的DNA链的酶消化和（3）单链探针的后续杂交，在不存在变性步骤的情况下。所产生的信号允许基于DNA的5'-3'方向性差异地标记每个姊妹染色单体，并评估指示C-SCE的异常染色模式。应用于人类着丝粒的Cen-CO-FISH方法揭示，人类着丝粒确实在循环细胞中发生重组，导致C-SCE，并且在经历衰老的癌细胞系和原代细胞中着丝粒不稳定性增强（Giunta和Funabiki，2017）。在这里，我介绍了人类细胞中Cen-CO-FISH方法的制备，实验程序和数据采集的详细方案。它还包括该技术的概念性概述，以及代表性图像和评分准则的示例。 Cen-CO-FISH是促进着丝粒重复探索的有用工具。
【背景】人类基因组计划于2003年标记为完成，但它遗漏了超过10％的人类重复DNA（de ...
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