| Site-specific DNA Mapping of Protein Binding Orientation Using Azidophenacyl Bromide (APB)
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] The orientation of a DNA-binding protein bound on DNA is determinative in directing the assembly of other associated proteins in the complex for enzymatic action. As an example, in a replisome, the orientation of the DNA helicase at the replication fork directs the assembly of the other associated replisome proteins. We have recently determined the orientation of Saccharalobus solfataricus (Sso) Minichromosome maintenance (MCM) helicase at a DNA fork utilizing a site-specific DNA cleavage and mapping assay. Here, we describe a detailed protocol for site-specific DNA footprinting ...
[摘要] [摘要 ] 结合在DNA上的DNA结合蛋白的方向决定了复合物中其他相关蛋白的组装，以进行有意的作用。例如，在复制体中，复制叉处的DNA解旋酶的方向指导我们最近通过定点DNA切割和作图分析确定了DNA叉处的Saccharalobus solfataricus （Sso ）微型染色体维持（MCM）解旋酶的方向。 使用4-叠氮苯甲酰溴（APB）进行位点特异性DNA足迹的详细协议。此方法提供了一种直接的生化方法来揭示Sso MCM解旋酶的DNA结合方向，并可应用于其他DNA结合蛋白。
[背景 ] DNA复制是其中基因组双链体链分离成两个模板链中，超前和滞后strands.This功能是通过在生命。如同其他环状六聚体的解旋酶结构域的所有的环状六聚体解旋酶的处理，从理论上讲，这些结构域中的任何一个都可以在易位期间朝向复制叉，并且与已知的3'-5 MCM包含两个结构域； N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）。' 易位directionality.T 他MCM解旋酶负载到DNA起源作为具有面向易位期间解旋酶的每个other.The取向管畸形双六聚体确定两个六聚体是否彼此或旁路彼此活性unwinding.Our最近的一篇论文中离解远表明Saccharolobus solfataricus （Sso MCM ）通过NTD引导DNA解链（Perera和Trakselis ...
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| Auxin-mediated Protein Degradation in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] The auxin-inducible degron (AID) technology was recently adapted for use in the nematode Caenorhabditis elegans. Rapid degradation of C. elegans proteins tagged with an AID is mediated by a plant-specific F-box protein, transport inhibitor response 1 (TIR1), and occurs only in the presence of the phytohormone auxin. The first iteration of this technology elicited protein degradation in C. elegans through a naturally occurring form of auxin, indole-3-acetic acid (IAA). Here, we present a protocol that uses 1-naphthaleneacetic acid, potassium salt (K-NAA), an ...
[摘要] [摘要 ] 植物生长素诱导的德隆（AID）技术最近被用于线虫秀丽隐杆线虫。带有AID标签的秀丽隐杆线虫蛋白的快速降解是由植物特异性F-box蛋白介导的，转运抑制剂反应1 （TIR1），而且只发生在存在的植物激素生长素。第一次迭代的这项技术引起蛋白质降解C. 线虫通过一个天然存在形式的生长素，吲哚-3-乙酸（IAA）。在此，我们协议用途1-萘乙酸，钾盐（K-NAA），一个，自由吲哚合成的植物生长素类似物。在相等浓度 ，K-NAA在标准线虫生长培养基（NGM）中与IAA一样有效。K-NAA在生理缓冲液（M9）中也有效，可以进行高通量实验。K-NAA的主要优点有两个：它的光稳定性可防止光诱导的化合物在储存过程中降解以及在活细胞的荧光显微镜检查过程中产生有毒的吲哚衍生物;其次，其水溶性消除了使用乙醇溶解植物生长素化合物（一种可能混淆C 的溶剂）的需要。线虫寿命和行为分析。在这个协议中，我们描述方法降解菌的C. elegans的使用K-NAA对固体和液体介质的蛋白质，以及我们的方法分析蛋白质降解。
[背景 ] 有条件的蛋白质降解通过降解决定子是一个新兴的方法研究蛋白质功能在秀丽隐杆线虫（拔头筹而Frokjaer -詹森2019年）。现在的降解决定子的方法包括ZF1 （Armenti 等人。2014年，萨累。等，2018） ，生长素诱导型德龙（AID）（Zhang ...
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| In vitro Measurement of CMP-Sialic Acid Transporter Activity in Reconstituted Proteoliposomes
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Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] Nucleotide-sugar transporters (NSTs) facilitate eukaryotic cellular glycosylation by transporting nucleotide-sugar conjugates into the Golgi lumen and endoplasmic reticulum for use by glycosyltransferases, while also transferring nucleotide monophosphate byproducts to the cytoplasm. Mutations in this family of proteins can cause a number of significant cellular pathologies, and wild type members can act as virulence factors for many parasites and fungi. Here, we describe an in vitro assay to measure the transport activity of the CMP-sialic acid transporter (CST), one of seven NSTs ...
[摘要] [ 摘要] 核苷酸糖转运蛋白（NST）通过将核苷酸糖结合物转运到高尔基腔和内质网供糖基转移酶使用，同时将核苷酸单磷酸副产物转移到细胞质中，从而促进了真核细胞的糖基化。该蛋白质家族的突变可引起许多重要的细胞病理，野生型成员可充当许多寄生虫和真菌的致病因子。在这里，我们描述了一种体外测定法，以测量CMP-唾液酸转运蛋白（CST）的转运活性，CMP-唾液酸转运蛋白（CST）是在哺乳动物中发现的七个NST之一。虽然在体外 以前已经针对CST进行了转运分析，但这些研究未能说明以下事实：1 ）CMP- 唾液酸（CMP-Sia ）的商业库存由约10％的高亲和力CMP组成，以及2）CMP- SIA 是水解d 到CMP和在水溶液中的唾液酸。在这里，我们描述了一种用非选择性磷酸酶南极磷酸酶治疗CMP-Sia的方法，以将所有游离CMP转化为胞苷。这使我们能够准确地测量重组为蛋白脂质体的纯化CST的底物亲和力和运输动力学。
[ 背景技术]一旦在细胞质或细胞核合成，核苷酸偶联的糖被输送到内质网的内腔（ER）由核苷酸-糖转运蛋白（NSTS）或高尔基体（青木等人，2003）。在这些亚细胞区室中，糖基转移酶利用糖部分糖基化脂质和蛋白质，产生副产物核苷酸单磷酸酯（NMP）（Capasso和Hirschberg，1984 ；Milla和Hirschberg ，1989； ...
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