| Flow Cytometry Measurement of Glucocerebrosidase Activity in Human Monocytes
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Glucocerebrosidase (GCase) is an important enzyme for the metabolism of glycolipids. GCase enzyme deficiency is implicated in human disease and the efficient measurement of GCase activity is important for evaluating the efficacy of therapeutics targeting this enzyme. Existing approaches to measure GCase activity include whole blood mass spectrometry-based assays, where an internal standard is used to measure the accumulation of ceramide following metabolism of the synthetic substrate C12-glucocerebroside, and the utilisation of fluorescent probes that bind active GCase and/or release ...
[摘要]
[摘要 ] 葡萄糖脑苷脂酶（GCase ）是糖脂代谢的重要酶。GCase 酶缺乏症与人类疾病有关，GCase 活性的有效测量对于评估靶向该酶的治疗剂的功效至关重要。现有的测量GCase 活性的方法包括基于全血质谱的分析，其中使用内标测量合成底物C12-葡萄糖脑苷代谢后神经酰胺的积累，以及利用结合活性GCase 和// 的荧光探针的利用。或通过GCase 裂解后释放荧光代谢物 。在这里，我们描述了基于荧光激活细胞分选术的测定方法的应用，以有效地定量人类外周血单核细胞单核细胞群中的GCase 酶活性。细胞渗透性的GCase 衬底5-（Pentafluorobenzoylamino ）荧光素二-β-D- 吡喃葡萄糖苷（PFB- FDGlu ）提供了一个用于测量的GCase 活性，由此酶裂解产生的绿色荧光PFB-F染料，在FL-检测流式细胞仪的1个通道。使用溶酶体GCase 活性抑制剂，conduritol B-环氧，以确保特异性。该协议为测量活的单个细胞中的GCase 活性提供了一种有利的方法。
[背景 ] 葡萄糖脑苷脂酶（GCase ），由 GBA1基因是一种溶酶体水解酶，可将葡糖神经酰胺转化为葡萄糖和神经酰胺。GBA1 ...
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| Measurement of Protein-Protein Interactions through Microscale Thermophoresis (MST)
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] The binding interactions of PD-1 and PD-L1 have been studied by surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC) over the past few years, but these investigations resulted in controversy regarding the values of the dissociation constant (Kd) (Freeman et al., 2000). MST is a powerful new method for the quantitative analysis of protein-protein interactions (PPIs) with low sample consumption. The technique is based on the movement of molecules along microscopic temperature gradients, and it detects changes in their hydration shell, charge or size. ...
[摘要] [摘要 ] 近年来，通过表面等离振子共振（SPR）和等温滴定热法（ITC）研究了PD-1和PD-L1的结合相互作用，但这些研究引起了解离常数值的争议。 （ķ d ）（弗里曼等人，2000） 。MST是一种功能强大的新方法，可定量分析低样品消耗的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。该技术基于分子沿微观温度梯度的移动，并检测其水合壳，电荷或大小的变化。一个结合蛋白摹伴侣荧光拉贝领导， 而另一个绑定伙伴仍保持无标签状态。我们使用的协议允许通过MST确定结合亲和力，而无需从细胞裂解物中纯化靶蛋白。将此MST方法应用于在CHO-K1细胞中表达的PD-1-eGFP和PD-L1-eGFP的应用，首次使我们能够确定PD-1及其配体PD-L1之间形成的复合物的亲和力在肿瘤逃逸期间。该协议在研究蛋白质与小分子之间的相互作用方面具有多种潜在应用。
[背景技术 [ 0002 ] 鉴定能够调节PD-1和PD-L1之间形成的复合物的亲和力的化合物代表了针对肿瘤免疫逃逸的新疗法的开发的重大进展。该方案涉及eGFP 融合蛋白的过表达，然后从细胞裂解物中提取eGFP 融合蛋白，无需任何纯化步骤即可测定PD-1和PD-L1之间的亲和常数。因此，该协议的发展需要产生eGFP 融合蛋白。该协议旨在通过避免繁琐的纯化步骤来定量加速蛋白质相互作用的表征。该协议还可以用于通过PD-1 / ...
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| Cell-free Reconstitution of the Packaging of Cargo Proteins into Vesicles at the trans Golgi Network
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Protein sorting at the trans Golgi network (TGN) plays important roles in targeting newly synthesized proteins to their specific destinations. The aim of this proposal is to reconstitute the packaging of non-Golgi resident cargo proteins into vesicles at the TGN, utilizing rat liver cytosol, semi-intact mammalian cells and nucleotides. The protocol describes how to perform the vesicle formation assay, how to isolate vesicles and how to detect cargo proteins in vesicles. This reconstitution assay can be used to quantitatively measure the efficiency of the packaging of a specific cargo ...
[摘要] [摘要] 反式高尔基体网络（TGN）上的蛋白质分选在将新合成的蛋白质靶向其特定目的地方面起着重要作用。该提议的目的是利用大鼠肝细胞溶质，半完整的哺乳动物细胞和核苷酸，在TGN处将非高尔基驻留的货物蛋白重新包装成囊泡。该协议描述了如何进行囊泡形成测定，如何分离囊泡以及如何检测囊泡中的货物蛋白。该重构测定法可用于定量测量在特定实验条件下将特定货物蛋白包装到TGN的运输小泡中的效率。
[背景] 的反式高尔基体网络（TGN）是在分泌运送路径的必要的交通枢纽。为了确保水泡运输的保真度，真核细胞利用各种蛋白质分选设备将特定的货物蛋白质准确地包装到TGN的运输小泡中，然后运至特定的目的地（Guo 等人，2014）。为了加深我们对TGN分选过程特异性的理解，重要的是开发一种能够忠实地重构TGN囊泡形成和货物分选过程的分析方法。该测定法可用于直接和定量地测量特定因子在调节特定货物蛋白包装到运输小泡中的作用。从内质网（ER）将货物蛋白包装到COPII囊泡中的无细胞重构已得到很好的建立（Kim 等，2005; Kim 等，2007; Merte 等，2010; Yuan 等。，2018；Niu 等，2019；）。已经开发出一种体外测定法，其在TGN处重构特定货物蛋白TGN46在运输小泡中的释放（Ponnambalam 等，1996；Wakana ...
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