| Measuring CD38 Hydrolase and Cyclase Activities: 1,N6-Ethenonicotinamide Adenine Dinucleotide (ε-NAD) and Nicotinamide Guanine Dinucleotide (NGD) Fluorescence-based Methods
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] CD38 is a multifunctional enzyme involved in calcium signaling and Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) metabolism. Through its major activity, the hydrolysis of NAD+, CD38 helps maintain the appropriate levels of this molecule for all NAD+-dependent metabolic processes to occur. Due to current advances and studies relating NAD+ decline and the development of multiple age-related conditions and diseases, CD38 gained importance in both basic science and clinical settings. The discovery and development of strategies to modulate its function and, ...
[摘要] CD38是参与钙信号传导和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD + ）代谢的多功能酶。通过其主要活性，NAD + 的水解，CD38有助于维持该分子的适当水平，从而发生所有NAD + 依赖性代谢过程。由于目前有关NAD + 下降和多种年龄相关疾病和疾病发展的研究和进展，CD38在基础科学和临床环境中都具有重要意义。调整其功能，可能治疗疾病和改善健康状况的战略的发现和发展使CD38成为焦点。因此，需要一种一致且可靠的方法来测量其活性并探索其在医学中的用途。我们在这里描述了我们的小组如何测量CD38的水解酶和环化酶活性的方法，利用基于荧光的酶测定法在平板阅读器中使用1，N 6 -Ethenonicotinamide Adenine Dinucleotide（ε-NAD）进行）和烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸（NGD）分别作为底物。
【背景】目前关于代谢功能障碍和虚弱的年龄相关发展的研究每天都有更多的证据。众所周知，随着老化的进行，NAD + 水平在预期过程中降低。最近的研究表明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD + ）的减少与年龄相关的代谢下降有关（Massudi et al。，2012）。增加NAD + 水平体内，导致延长寿命和健康跨度相关因素的活化，并改善衰老的几个生理和代谢参数（Camacho-Pereira ...
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| Expansion of Airway Basal Cells and Generation of Polarized Epithelium
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Airway basal stem cells are the progenitor cells within the airway that exhibit the capacity to self-renew and give rise to multiple types of differentiated airway epithelial cells. This stem cell-derived epithelium displays organized architecture with functional attributes of the airway mucosa. A protocol has been developed to culture and expand human airway basal stem cells while preserving their stem cell properties and capacity for subsequent mucociliary differentiation. This achievement presents a previously unrealized opportunity to maintain a durable supply of progenitor cells derived ...
[摘要] 气道基底干细胞是气道内的祖细胞，表现出自我更新的能力并产生多种类型的分化的气道上皮细胞。这种干细胞来源的上皮细胞显示出具有气道粘膜功能属性的有组织的结构。已经开发了一种方案来培养和扩展人气道基底干细胞，同时保持其干细胞特性和后续粘液分泌的能力。这项成就提供了一个以前未实现的机会，以保持源自健康供体的祖细胞的持久供应，以分化为用于基于细胞和分子的研究的人原发性气道上皮。此外，基底干细胞可以从患有特定气道疾病的患者（例如囊性纤维化）中收集，从而能够在适当的气道粘膜环境下研究疾病特异性细胞的潜在改变的行为。在这里，我们详细描述了一系列气道基底干细胞系列扩增的方案，以实现几乎无限制的气道基底细胞的生成，这些细胞可以储存并随时用于随后的培养和分化。此外，我们描述了气液基底干细胞在空气 - 液体界面处的可渗透Transwell过滤器上的培养和分化，以创建功能性粘膜睫毛伪分层极化气道上皮粘膜。
【背景】气道疾病建模和药物发现已经从在气液界面（ALI）的可渗透Transwell过滤器上生长的原代呼吸道上皮培养物的开发和使用中获益。与永生化细胞系相比，该模型具有几个优点，即原代上皮细胞可以分化成具有多种上皮细胞类型（包括纤毛，浆膜和基底细胞）的气道粘膜，并且它们的排列在体内是相当反映的蜂窝组织。主要的ALI模型表现出功能性微生理过程，包括跳动纤毛和分泌粘液的能力，这些特征在细胞系衍生的上皮单层中显着不存在。此外，原代细胞不依赖于人工永生化或转化，因为细胞系来源的上皮细胞确实存在，因此不受细胞系中可能发生的错误信号传导的阻碍，这可能会错误地表示气道上皮中发生的过程。尽管有这些显着的限制，永生化细胞系被广泛用于模拟和研究气道上皮细胞，因为原发性气道上皮细胞存在自己的一系列挑战。原代上皮细胞在传代数次后无法复制，必须连续收获并分离以完成每组研究。另外，改变或缺失感兴趣基因表达的分子生物学技术难以实现，并且与原代上皮细胞一起维持。这些缺点造成成本和技术障碍，阻碍了原发性ALI培养物的广泛使用，尽管它们在调查气道粘膜方面有明显优势。 ...
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| Cobblestone Area-forming Cell Assay of Mouse Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells (HSCs) require bone marrow microenvironment for their maintenance and proliferation. Culture of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) provides appropriate environmental signals for HSCs survival in vitro. Here, we provide a detailed protocol that describes culture conditions for MSCs, flow cytometric isolation of HSCs from mouse bone marrow, and perform co-culture of MSCs and HSCs known as Cobblestone area-forming cell (CAFC) assay. Altogether, CAFC assays can be used as a high-throughput in vitro screening model where efforts are ...
[摘要] 骨髓造血干细胞（HSC）需要骨髓微环境来维持和增殖。 骨髓间充质基质细胞（MSC）的培养为体外HSC存活提供适当的环境信号。 在这里，我们提供了描述MSCs培养条件的详细方案，从小鼠骨髓中流式细胞术分离HSCs，并进行称为鹅卵石区域形成细胞（CAFC）分析的MSC和HSC的共培养。 总而言之，CAFC分析可用作高通量体外筛选模型，其中努力了解和开发复杂骨髓疾病的治疗方法。 该方案需要培养MSC，分离LSK细胞（HSC）和执行有限稀释CAFC测定3至4周。
【背景】HSC的增殖，存活和分化潜力非常依赖于其微环境，也被称为小生境。骨髓MSC支持HSC以使其在骨髓龛中保持静止状态。由生态位接收的内在和外在信号有助于将HSC分化为也称为造血的成熟血细胞谱系，而不诱导异常扩增（Yoshihara等人，2007; Spindler等人 ，2014; Hu等人，2016）。鹅卵石区域形成细胞试验（CAFC试验）是长期骨髓HSC和MSC的体外共培养试验。当培养MSC在组织培养皿中完成融合时，将HSC铺在MSC上（de Haan和Ploemacher，2002）。 CAFC测定与骨髓的体内研究相当，并且可用作快速筛选测定以测试HSC的干细胞活性和MSC的支持活性（Ploemacher等人， ...
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