| Isolation of Chromatin-bound Proteins from Subcellular Fractions for Biochemical Analysis
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Shuttling of proteins between different cellular compartments controls their proteostasis and can contribute in some cases to regulate their activity. Biochemical analysis of chromatin-bound proteins, such as transcription factors, is often difficult because of their low yield and due to the interference from nucleic acids. This protocol describes a method to efficiently fractionate cells combined with a mechanical (i.e., sonication) or an enzymatic treatment (i.e., benzonase) that facilitates analysis of chromatin-bound protein extracts by Western blot analysis or by ...
[摘要] 在不同细胞区室之间穿梭蛋白质控制它们的蛋白质稳态，并且在某些情况下可以有助于调节它们的活性。 染色质结合蛋白（例如转录因子）的生化分析通常是困难的，因为它们的产率低并且由于核酸的干扰。 该协议描述了一种有效分离细胞的方法，结合机械（即，超声处理）或酶处理（即，benzonase），有助于分析染色质结合蛋白提取物 通过蛋白质印迹分析或蛋白质下拉分析。 该方法对于富集特定亚细胞级分内的特定蛋白质以研究特定的翻译后修饰模式或鉴定特定的蛋白质 - 蛋白质相互作用可能是有价值的。
【背景】许多染色质结合蛋白的活性和翻译后调节研究很少，因为在分离它们进行生化分析时存在技术困难。这甚至是转录因子的情况，例如基本的螺旋 - 环 - 螺旋（bHLH）转录因子，其通常在组织或细胞模型中具有稀缺的时间和空间表达模式（Dennis 等。，2018）。当生物材料的量成为研究分子途径的障碍时，协议细化有助于解除技术限制（Gillotin和Guillemot，2016）。在我们最近的研究中，我们努力了解神经元bHLH转录因子Ascl1的蛋白水解是如何在神经元分化的细胞模型中调节的（Gillotin et ...
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| RNA Cap Methyltransferase Activity Assay
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Methyltransferases that methylate the guanine-N7 position of the mRNA 5’ cap structure are ubiquitous among eukaryotes and commonly encoded by viruses. Here we provide a detailed protocol for the biochemical analysis of RNA cap methyltransferase activity of biological samples. This assay involves incubation of cap-methyltransferase-containing samples with a [32P]G-capped RNA substrate and S-adenosylmethionine (SAM) to produce RNAs with N7-methylated caps. The extent of cap methylation is then determined by P1 nuclease digestion, thin-layer chromatography (TLC), and phosphorimaging. ...
[摘要] 甲基化mRNA 5'帽结构的鸟嘌呤-N7位置的甲基转移酶在真核生物中普遍存在并且通常由病毒编码。这里我们提供生物样品的RNA帽甲基转移酶活性的生化分析的详细方案。该测定包括将含有帽 - 甲基转移酶的样品与[32 P] G-加帽的RNA底物和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）温育以产生具有N7-甲基化帽的RNA。然后通过P1核酸酶消化，薄层色谱（TLC）和磷成像确定帽甲基化的程度。此处描述的方案包括用于产生[32 P] G-加帽的RNA底物和用于从哺乳动物细胞制备核和细胞质提取物的附加步骤。该分析也适用于分析其他生物样品（包括重组蛋白制剂和来自分析分离和免疫沉淀/下拉实验的级分）的帽甲基转移酶活性。
【背景】mRNA的5'端的N7-甲基鸟苷帽是适当的真核mRNA加工，定位和翻译所必需的修饰。 ...
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| CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and ...
[摘要] 定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法，使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时，这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用，它适用于可溶性和不可溶性成分，包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心，其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。
【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上，通过免疫共沉淀（共-IP）和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而，一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解，下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得，这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物，邻近依赖性生物素鉴定（BioID）提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”（Roux等人，2012年）。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶（BirA）。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体（Roux et al。，2012; Van Itallie et al。，2013） ...
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