| Mouse Model of Immune Complex-mediated Vasculitis in Dorsal Skin and Assessment of the Neutrophil-mediated Tissue Damage
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] Neutrophils are the most abundant leukocytes in the blood. In the recent decades, their crucial roles in host defense, immune regulation and tissue damage have been studied in a deeper dimension. In this protocol, we described a mouse model of immune complex-mediated vasculitis in the dorsal skin induced by Arthus reaction, and the subsequent analysis of edema, hemorrhage and tissue damage due to neutrophil activation by means of Evans blue area analysis, histology, and immunofluorescence. This protocol could facilitate the investigation of cellular therapy strategy against over-activated ...
[摘要] 嗜中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞。 近几十年来，它们在宿主防御，免疫调节和组织损伤方面的关键作用已经得到了更深入的研究。 在这个协议中，我们描述了Arthus反应诱导的背部皮肤中的免疫复合物介导的血管炎的小鼠模型，以及随后通过伊文思蓝区域分析，组织学和分析由于嗜中性粒细胞活化引起的水肿，出血和组织损伤免疫荧光。 该协议可以促进细胞治疗策略对过度活化的嗜中性粒细胞介导的组织损伤的调查。
【背景】嗜中性粒细胞构成循环白细胞的最大的进化保守部分。他们引导第一波主机防御感染或组织损伤。嗜中性粒细胞介导的细胞毒性的体外模型已被充分证实（Incani等人，1981; Dallegri等人，1984; Saffarzadeh等人，等人，2012年）。但是，为了剖析中性粒细胞介导的无菌组织损伤的复杂性，“体内”模型是必不可少的。
免疫复合物（IC）介导的血管炎是由抗原 - 抗体复合物在血管中沉积引发的疾病，其随后导致补体激活，嗜中性粒细胞募集和活化。活化的嗜中性粒细胞释放的大量活性氧和蛋白酶损害血管壁的内皮衬里并导致水肿和出血（Sindrilaru等人，2007; Goerge等人， ，2008; ...
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| Staining of Membrane Receptors with Fluorescently-labeled DNA Aptamers for Super-resolution Imaging
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] One of the most prominent applications of fluorescent super-resolution microscopy is the study of nanodomain arrangements of receptors and the endocytic pathway. Staining methods are becoming crucial for answering questions on the nanoscale, therefore, the use of small and monovalent affinity probes is of great interest in super-resolution microscopy with biological samples. One kind of affinity probe is the aptamer. Aptamers are single DNA or RNA sequences that bind with high affinity to their targets and due to their small size they are able to (i) place the fluorophore in close proximity ...
[摘要] 荧光超分辨率显微镜的最突出的应用之一是研究纳米结构的受体和内吞途径。染色方法对于回答纳米尺度的问题变得至关重要，因此，使用小型和单价亲和探针在具有生物样品的超分辨显微镜中是非常有意义的。一种亲和力探针是适体。适配体是以高亲和力结合其靶标的单个DNA或RNA序列，并且由于它们的小尺寸，它们能够（i）将荧光团置于感兴趣的蛋白质附近，并且（ii）与大部分蛋白质结合有利于克服空间位阻效应，导致更好的染色密度。在这里，我们描述一个详细的协议，使用适配体染色活细胞，并用刺激的排放消耗（STED）显微镜对其进行成像。在该方案中，染色用市售适用于靶向表皮生长因子受体（EGFR），人表皮生长因子受体2（HER2或ErbB2）和ephrin-A受体2（Epha2）的适体进行。由于适配体可与大部分受欢迎的荧光团偶联，因此我们认为本文介绍的方法可扩展到目前超分辨率显微镜技术的绝大多数。
【背景】超分辨率成像技术的最新进展已经导致搜索更精确的方法来标记细胞元件。衍射无限成像仪器提供优异的分辨率，然而标准样品染色方法，如免疫染色，缺乏检测细胞元素所必需的精度。由于它们的大尺寸（长度约15nm）和高分子量（〜150kDa），抗体可以很差地渗透到生物样品中。另外，一次/二次抗体复合物将荧光团放置在远离靶的大约25nm处，从而损害检测精度。此外，由于初级/二级抗体复合物的大尺寸，由于空间位阻（Fornasiero和Opazo，2015），较小部分的靶标可以被标记。这导致较低的标记密度，这是超分辨率显微镜的关键参数，特别是在识别和描述纳米结构时。为了克服这些问题，近年来已经测试了与单个靶（单价）结合的小的亲和力探针，如适体，亲和体或纳米体系（Rothbauer ...
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| In vitro Demonstration and Quantification of Neutrophil Extracellular Trap Formation
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] In the recent decade, neutrophil extracellular traps (NETs) have been identified and confirmed as a new anti-microbial weapon of neutrophils. In this protocol, we describe easy methods to demonstrate NET formation by immunofluorescence staining of extracellular chromatin fiber with anti-DNA/Histone H1 antibody and quantification of NETs by using a non-cell-permeable DNA specific dye Sytox orange.
[摘要] 近十年来，嗜中性粒细胞胞外捕获物（NETs）已被鉴定并确认为一种新的抗微生物中性粒细胞武器。 在该方案中，我们描述了通过使用抗DNA /组蛋白H1抗体的细胞外染色质纤维的免疫荧光染色和通过使用非细胞可渗透的DNA特异性染料Sytox orange来定量NETs的简便方法来证明NET形成。
【背景】嗜中性粒细胞构成循环白细胞中最大的进化保守部分。他们通过各种机制建立了针对病原体的第一道防线，包括形成嗜中性粒细胞胞外捕获物（NETs）。在此过程中，活化的嗜中性粒细胞从细胞核中排出染色质纤维。入侵的病原体然后被捕获在染色质网络内并被高度浓缩的NET缠结的抗微生物蛋白如髓过氧化物酶（MPO）和弹性蛋白酶（Brinkmann等人，2004）杀死。然而，NETs是一把双刃剑;来自过度活化的嗜中性粒细胞的无限制的NET形成也可能导致严重的组织损伤，例如通过NET的组蛋白组分的细胞毒性作用（Saffarzadeh等人，2012）。中性粒细胞过度活化并具有增强的形成NETs的能力的病理状况的一个例子是系统性红斑狼疮。狼疮患者血清中针对双链DNA及其它组分的抗体水平升高（Knight and Kaplan，2012; Yu and ...
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