| Activity-based Pull-down of Proteolytic Standard and Immunoproteasome Subunits
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Activity-based probes (ABP) are small organic molecules that irreversibly bind to the active center of a specific enzyme family and may be coupled to a fluorophore or an affinity tag (Li et al., 2013). Here, we describe a method to pull-down active catalytic standard and immunoproteasome subunits in cell lysates using the biotinylated, proteasome-specific ABP Biotin-Epoxomicin (Bio-EP). Covalent labeling of the active catalytic subunits with Bio-EP is followed by a pull-down using streptavidin-coated beads. After elution from the beads, enriched subunits may be detected via Western ...
[摘要] 基于活性的探针（ABP）是不可逆地结合特定酶家族的活性中心并且可以偶联至荧光团或亲和标签的小有机分子（Li等人，2013）。在这里，我们描述了使用生物素化的蛋白酶体特异性ABP生物素 - 环氧丙素（Bio-EP）在细胞裂解物中下拉活性催化标准和免疫蛋白酶体亚基的方法。用Bio-EP共价标记活性催化亚单位，然后使用链霉抗生物素蛋白包被的珠子进行下拉。从珠中洗脱后，可以通过Western印迹，串联质谱法（Li et al。，2013）或其他技术检测富集的亚单位。
背景 蛋白酶体是存在于真核细胞的细胞核和细胞质中的桶形多分子酶复合物。蛋白质降解是重要的，包括加工MHC I呈递的抗原肽，并调节许多细胞过程（Kammerl和Meiners，2016）。在造血起源的细胞中，标准（组成型）蛋白酶体通常被免疫蛋白酶体（Meiners等人，2014）所替代，其在三种不同的催化活性β-亚基的掺入中不同（图1）。
为了研究单个催化亚基的分子功能并调节生理过程，亚基特异性蛋白酶体抑制剂的发展是必不可少的。 de ...
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| Generation of IgG-Fc Glycovariants Using Recombinant Glycosidases and Glycosyltransferases
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Author:
Date:
2016-08-05
[Abstract] The immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable (Fc) domain contains a single, highly conserved asparagine 297 (N297) glycosylation site in the CH2 domain, which is buried within the hydrophobic core of each of the two heavy chains. The biantennary core glycan structure, composed of 2 N-acetylglucosamine (GlcNAc) and 3 mannose residues, can be further decorated with fucose, bisecting GlcNAc and terminal GlcNAc, galactose, and sialic acid. Presence or absence of distinct residues can alter IgG effector functions such as antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or ...
[摘要] 免疫球蛋白G（IgG）片段可结晶（Fc）结构域在CH2结构域中包含单个，高度保守的天冬酰胺297（N297）糖基化位点，其掩埋在两条重链的每一条的疏水核内。由2个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和3个甘露糖残基组成的双触角核心聚糖结构可以进一步用岩藻糖，二等分GlcNAc和末端GlcNAc，半乳糖和唾液酸装饰。不同残基的存在或不存在可以改变IgG效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或补体依赖性细胞毒性（CDC）。在这里，我们提供使用重组糖苷酶和糖基转移酶产生IgG-Fc去半乳糖基化，半乳糖基化，去唾液酸化和唾液酸化IgG抗体的方案。
[背景] 糖基转移酶用于抗体聚糖修饰的用途允许将糖底物连接到预先存在的聚糖残基上。免疫球蛋白G在其每个CH2结构域中携带单个高度保守的N-糖基化位点（Arnold等人，2007）（图1），允许用糖基转移酶进行位点特异性聚糖修饰。如果抗体的Fab结构域含有Asn-X-Ser/Thr（X≠Pro）序列（Mellquist等人，1998），则抗体可携带额外的N-聚糖。因此，仔细选择缺少Fab糖基化的单克隆抗体对于Fc特异性聚糖修饰是重要的。本文所述的方案是基于以下出版物开发的（Kingston，2003; Kaneko等人，2006; Anthony等人，2008; Barb等人。，2009; Quast ...
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| Measurement of IFN-α Subtype Concentrations (Virus-free, Cell-based Bioassay)
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Author:
Date:
2013-06-20
[Abstract] The induction of type I IFN is the immediate host response against viral infections. Type I IFNs belong to a multigene family including up to 14 different IFN-α subtypes and one IFN-β. They are highly conserved and bind the same receptor (IFNAR1/2) with varying affinities, although they differ in their biological activities.
[摘要] I型IFN的诱导是针对病毒感染的直接宿主应答。 I型IFNs属于多基因家族，包括多达14种不同的IFN-α亚型和一种IFN-β。 它们是高度保守的，并以不同的亲和力结合相同的受体（IFNAR1/2），尽管它们的生物活性不同。
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