| Evaluation of the Efficiency of Genome Editing Tools by a Frameshift Fluorescence Protein Reporter
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Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] In the last decade, genome editing has been the center of attention as a novel tool for mechanistic investigations and for potential clinical applications. Various genome editing tools like meganucleases, zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector-based nucleases (TALEN), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated genes (Cas), have been developed in recent years. For the optimal use as well as continued developments of these genome editing tools, the evaluation of their efficiencies and accuracies is vital. Here, we present a ...
[摘要] [摘要] 在过去的十年中，基因组编辑作为一种机制研究和潜在临床应用的新工具已成为关注的焦点。近年来，已开发出各种基因组编辑工具，例如大范围核酸酶，锌指核酸酶（ZFN），转录激活子样基于效应子的核酸酶（TALEN）以及成簇的规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）相关基因（Cas）。 。对于这些基因组编辑工具的最佳使用和持续发展，评估其效率和准确性至关重要。在这里，我们介绍了一种基于移码荧光蛋白的报告子方案，我们最近开发了该方案以评估效率和 基因组编辑工具的实用性。在这种方法中，在天蓝色荧光蛋白（CFP）的起始密码子后插入一个约20 bp的包含移码的靶序列，以使其荧光失活，并且只有新的插入/缺失事件会重新激活CFP 荧光。 。为了增加可追溯性，将内部核糖体进入位点和红色荧光蛋白mCherryFP 放置在报告子的下游。由in / del介导的荧光恢复产生的CFP阳性细胞的百分比可以通过荧光测量装置定量，作为基因组编辑频率的读数。作为演示，我们在这里介绍CRISPR-Cas9技术的使用以及流式细胞仪作为荧光变化的读数。
[背景] 基因组编辑工具对于生物学机制的研究以及遗传疾病的预防和/或治疗非常重要（Maeder和Gersbach，2016）。在最近的几十年中，引入了几种基因组编辑工具，包括大范围核酸酶（Epinat 等，2003），锌指核酸酶（ZFN）（Kim ...
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| A Lentiviral Pseudotype ELLA for the Measurement of Antibodies Against Influenza Neuraminidase
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] This protocol describes the rapid and safe production of lentiviral pseudotypes characterized by a lentiviral core containing a reporter, in conjunction with avian influenza haemagglutinin (HA) and human neuraminidase (NA) glycoproteins on the surface. Production is optimized with Endofectin LentiTM transfection reagent in 6-well plate format. These pseudotyped viruses can be employed for serological assays of surface glycoproteins HA and NA. They can be efficiently used to perform the ELLA (Enzyme-linked lectin assay) to measure NA inhibiting antibodies in lieu of using ...
[摘要] 该方案描述了慢病毒假型的快速和安全生产，其特征在于含有报道分子的慢病毒核心，以及表面上的禽流感血凝素（HA）和人神经氨酸酶（NA）糖蛋白。 使用6孔板形式的Endofectin Lenti TM 转染试剂优化生产。 这些假型病毒可用于表面糖蛋白HA和NA的血清学测定。 它们可以有效地用于进行ELLA（酶联凝集素测定）以测量NA抑制抗体，而不是使用重配病毒或Triton X-100灭活的野生型病毒作为抗原来源，这可能需要更高的生物安全水平。
【背景】流感病毒假型的产生先前已被广泛描述（Nefkens et al。，2007; Temperton et al。，2007; Carnell et al。，2015）。需要一种安全快速的系统来评估通过ELLA测定靶向NA的抗体，避免使用重配错配病毒或野生型病毒，这已经通过产生携带NA型流感假型来满足（Prevato et al。，2015）。最近的一项研究（Biuso et al。，2017）证实HA与NA的共表达改善了新形成的假型慢病毒的释放。在这里，我们报告了一种简单，广泛适用和优化的PV生产方案，使用6孔板格式的Endofectin Lenti TM ...
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| An Optimized Method for the Production Using PEI, Titration and Neutralization of SARS-CoV Spike Luciferase Pseudotypes
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] The protocol outlined represents a cost-effective, rapid and reliable method for the generation of high-titre viral pseudotype particles with the wild-type SARS-CoV spike protein on a lentiviral vector core using the widely available transfection reagent PEI. This protocol is optimized for transfection in 6-well plates; however it can be readily scaled to different production volumes according to application. This protocol has multiple benefits including the use of readily available reagents, consistent, high pseudotype virus production Relative Luminescence Units (RLU) titres and rapid ...
[摘要] 概述的方案代表了使用广泛可用的转染试剂PEI在慢病毒载体核心上产生具有野生型SARS-CoV刺突蛋白的高滴度病毒假型颗粒的成本效益，快速和可靠的方法。 该协议针对6孔板中的转染进行了优化; 然而，根据应用，它可以容易地扩展到不同的生产量。 该方案具有多种益处，包括使用容易获得的试剂，一致的，高假型病毒生产相对发光单位（RLU）滴度，并快速产生用于研究菌株变异，趋向性和免疫原性/血清流行性的新型冠状病毒假型。
【背景】假型病毒颗粒（PV）的生产和使用对于许多病毒是广泛建立的，并且在血清学，监测和疫苗开发领域的应用是多方面的（Temperton等人，2015; Carnell等人，2015）。 PV已经被证明是研究病毒包膜糖蛋白突变对血清学结果，病毒向性和免疫原性研究的影响的有力工具，特别是当与表位信息结合时。 PV是嵌合病毒构建体，其中一个病毒的外（表面）糖蛋白与另一病毒的复制缺陷病毒核心组合。 ...
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