| Host-regulated Hepatitis B Virus Capsid Assembly in a Mammalian Cell-free System
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] The hepatitis B virus (HBV) is an important global human pathogen and represents a major cause of hepatitis, liver cirrhosis and liver cancer. The HBV capsid is composed of multiple copies of a single viral protein, the capsid or core protein (HBc), plays multiple roles in the viral life cycle, and has emerged recently as a major target for developing antiviral therapies against HBV infection. Although several systems have been developed to study HBV capsid assembly, including heterologous overexpression systems like bacteria and insect cells, in vitro assembly using purified ...
[摘要] 乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的全球人类病原体，并且是肝炎，肝硬化和肝癌的主要原因。 HBV衣壳由单个病毒蛋白的多个拷贝组成，衣壳或核心蛋白（HBc）在病毒生命周期中起着多重作用，并且最近已经成为开发抗HBV病毒疗法的主要靶标。尽管已经开发了几种用于研究HBV衣壳组装的系统，包括异源过表达系统如细菌和昆虫细胞，使用纯化蛋白质和哺乳动物细胞培养系统进行体外组装，但对非生理浓度HBc和盐以及难以操纵装配的宿主调节物在生理相关条件下的衣壳装配的详细研究方面存在主要限制。我们最近开发了基于兔网织红细胞裂解物（RRL）的哺乳动物无细胞系统，其中HBc以生理浓度表达并在近生理条件下组装成衣壳。该系统已经揭示了HBc装配要求，这是以前装配系统所不能预料的。此外，该系统中的衣壳组装受可容易操作的内源宿主因子调控。在这里，我们提供了这种无细胞衣壳装配系统的详细协议，包括如何操纵调节装配的宿主因子的说明。
【背景】乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的全球人类病原体，其长期感染全世界数以亿计的人并且代表病毒性肝炎，肝硬化和肝癌的主要原因（Seeger等人， 2013; Trepo et。，2014）。 HBV通过逆转录RNA中间体（所谓的前基因组RNA（pgRNA））在核衣壳内（NC）复制其基因组DNA（一种宽松的环状部分双链DNA（RC ...
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| Precision Tagging: A Novel Seamless Protein Tagging by Combinational Use of Type II and Type IIS Restriction Endonucleases
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Protein tagging is a powerful tool for performing comprehensive analyses of the biological functions of a protein of interest owing to the existence of a wide variety of tags. It becomes indispensable in some cases, such as in tracking protein dynamics in a live cell or adding a peptide epitope due to the lack of optimal antibodies. However, efficiently integrating an array of tags into the gene of interest remains a challenge. Traditional DNA recombinant technology based on type II restriction endonucleases renders protein tagging tedious and inefficient as well as the introduction of an ...
[摘要] 由于各种标签的存在，蛋白质标签是一种对感兴趣的蛋白质的生物学功能进行全面分析的有力工具。在某些情况下，例如跟踪活细胞中的蛋白质动态变化或由于缺乏最佳抗体而添加肽表位，这变得不可或缺。然而，将一系列标签有效地整合到感兴趣的基因中仍然是一个挑战。基于II型限制性内切核酸酶的传统DNA重组技术使得蛋白质标记繁琐且效率低下以及引入不需要的连接序列。我们试图标记我们确定为第一个颅内动脉瘤基因的血小板反应蛋白1型结构域1（THSD1）（Santiago-Sim等人，2016），我们开发了一种新型精确标记技术，组合使用II型和IIS限制性核酸内切酶（Xu等人，2017），其产生高效率的无缝克隆。在这里，我们描述了一个协议，不仅为任何感兴趣的基因提供了一个广义的策略，而且还将THSD1中的11个不同标签的应用作为一个循序渐进的例子。
【背景】具有不同特征的多功能标签可以作为一组分析蛋白质功能的工具。诸如绿色荧光蛋白（GFP）标签及其衍生物，串联亲和纯化标签（如FLAG-HA或ProtA-CBP）的各种标签多年来革新了生物学研究。一些新开发的化学标签，如SNAP或CLIP，允许以时间控制的方式有条件地标记感兴趣的蛋白质（Bodor等人，2012）。然而，有效地将尽可能多的不同标签整合到感兴趣的基因中的方法发展不足。
传统的DNA重组利用识别回文序列的II型限制性内切核酸酶。例如，Eco ...
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| Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] With the recent implementation of the CRISPR/Cas9 technology as a standard tool for genome editing, laboratories all over the world are undergoing one of the biggest advancements in molecular biology since PCR. The key advantage of this method is its simplicity and universal applicability for species of any phylum. Of particular interest is the extensively studied Gram-negative bacterium Escherichia coli, as it is considered as the workhorse for both research and industrial purposes. Here, we present a simple, robust and effective protocol using the CRISPR/Cas9 system in combination ...
[摘要] 随着CRISPR / Cas9技术作为基因组编辑的标准工具的最近实施，全世界的实验室正在经历PCR以来分子生物学方面最大的进步之一。这种方法的关键优点是其简单和普遍适用于任何物种的门。特别感兴趣的是广泛研究的革兰氏阴性细菌大肠杆菌，因为它被认为是研究和工业用途的主力。在这里，我们提出了一个简单，强大和有效的协议，使用CRISPR / Cas9系统结合λ红色基因敲除机器。大肠杆菌。在我们的程序中最重要的是使用双链供体DNA和固化策略来去除导向RNA编码质粒，其允许在仅仅两个工作日后开始新的突变。我们的方案允许多个具有高诱变效率的基因敲除株，适用于高通量的方法。
【背景】革兰氏阴性细菌大肠杆菌是生物技术工程中最重要的生物之一。已在能源，农业，食品生产，生物技术，医药等不同行业的各种流程中成功实施。由于不断的技术进步，生物技术部门正在迅速发展。特别是，CRISPR / Cas9技术可能是PCR（分子）生物学最大的革命（Ledford，2015）。简而言之，CRISPR / Cas9保护细菌免受诸如质粒和病毒等侵入性遗传因子的影响（Marraffini，2015）。利用这种从原核生物获得的免疫系统，已经开发了基于CRISPR / Cas9系统的基因组编辑的非常有力的工具（Jinek等人，2012）。
CRISPR / ...
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