| Long-term in vitro Culture of Cryptosporidium parvum
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Continuous in vitro growth of Cryptosporidium parvum has proved difficult and conventional in vitro culture techniques result in short-term (2-5 days) growth of the parasite resulting in thin-walled oocysts that fail to propagate using in vitro cultures, and do not produce an active infection using immunosuppressed or immunodeficient mouse models (Arrowood, 2002). Here we describe the use of hollow fiber bioreactors (HFB) that simulate in vivo conditions by providing oxygen and nutrients to host intestinal cells from the basal surface and permit ...
[摘要] Cryptosporidium parvum 的连续体外生长已证明是困难的，并且常规体外培养技术导致短期（2-5天）生长寄生虫导致薄壁卵囊不能使用体外培养物繁殖，并且不使用免疫抑制或免疫缺陷小鼠模型产生活跃感染（Arrowood，2002）。在这里，我们描述了中空纤维生物反应器（HFB）的使用，通过提供氧气和营养物质从基础表面宿主肠细胞模拟体内条件，并允许建立低氧化还原，高营养环境顶面。当接种10 5 C时。 parvum （爱荷华州分离物）卵囊生物反应器在14天后每ml产生10个 8 卵囊（20ml额外毛细血管体积），并保持2年以上。使用TCR-α免疫缺陷小鼠模型的体内感染性研究显示，在6,12和18个月时从生物反应器产生的卵囊与用于启动培养的亲本Iowa分离物无法区分。 HFB产生的卵囊具有与亲本爱荷华分离物类似的百分比分析。
【背景】 Cryptosporidium parvum 是人和其他哺乳动物肠道的细胞内专性寄生虫，导致急性腹泻。该疾病在免疫功能正常的个体中是自限性的，然而，在免疫功能低下的成人和幼儿中，该疾病可能危及生命（Kotloff，2017）。它是经济资源低的国家中三种被诊断出的儿童肠道疾病之一（Kotloff et al。，2013; Sow et ...
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| Mammalian Cell-derived Vesicles for the Isolation of Organelle Specific Transmembrane Proteins to Conduct Single Molecule Studies
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Cell-derived vesicles facilitate the isolation of transmembrane proteins in their physiological membrane maintaining their structural and functional integrity. These vesicles can be generated from different cellular organelles producing, housing, or transporting the proteins. Combined with single-molecule imaging, isolated organelle specific vesicles can be employed to study the trafficking and assembly of the embedded proteins. Here we present a method for organelle specific single molecule imaging via isolation of ER and plasma membrane vesicles from HEK293T cells by employing OptiPrep ...
[摘要] 细胞衍生的囊泡促进跨膜蛋白在其生理膜中的分离，从而维持其结构和功能完整性。 这些囊泡可以由产生，容纳或运输蛋白质的不同细胞器产生。 结合单分子成像，可以使用分离的细胞器特异性囊泡来研究嵌入蛋白质的运输和组装。 在这里，我们提出了一种通过使用OptiPrep梯度和氮气穴通过从HEK293T细胞中分离ER和质膜囊泡来进行细胞器特异性单分子成像的方法。 通过Western印迹验证分离，并使用分离的囊泡进行寡聚受体组装的单分子研究。
【背景】大量的跨膜蛋白通过多个亚基的组装形成，导致复杂的寡聚结构，其可以通常以多种化学计量存在。了解组装中的变化如何改变在不同细胞器中的贩运和本地化对于确定蛋白质的生理作用以及与成熟和运输相关的疾病的连接至关重要。单分子方法可以通过直接测量其化学计量比来更好地理解寡聚蛋白的组装（Ulbrich和Isacoff，2007; Richards等人，2012）。这种方法避免了整体平均，从而提供了所有化学计量的平均状态（Walter and Bustamante，2014）。单分子研究近来已被用于理解大分子的结构和功能特性，包括构象动力学（Tan等人，2014），离子通道门控（Wang等人 ，2016），配体 - 受体相互作用（Moonschi等人，2015）和化学计量组装（Ulbrich和Isacoff，2007; ...
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| Imaging Cytokine Concentration Fields Using PlaneView Imaging Devices
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] We describe here a method to visualize concentration fields of cytokines around cytokine-secreting cells. The main challenge is that physiological cytokine concentrations can be very low, in the pico-molar range. Since it is currently impossible to measure such concentrations directly, we rely on cell’s response to the cytokines–the phosphorylation of a transcription factor–that can be visualized through antibody staining. Our devices aim at mimicking conditions in dense tissues, such as lymph nodes. A small number of secreting cells is deposited on a polylysine-coated glass and covered by ...
[摘要] 我们在这里描述了一种可视化细胞因子分泌细胞周围细胞因子浓度场的方法。主要挑战是生理细胞因子浓度可能非常低，在微摩尔浓度范围内。由于目前不可能直接测量这样的浓度，我们依赖于细胞对细胞因子的反应 - 转录因子的磷酸化 - 可以通过抗体染色显现。我们的设备旨在模仿密集组织中的条件，如淋巴结。少数分泌细胞沉积在聚赖氨酸包被的玻璃上并被多层细胞因子消耗覆盖。将细胞连通1小时，之后去除顶层，并且细胞的底层被抗体标记为对细胞因子的应答。然后通过标准荧光显微镜观察细胞因子场的横截面。这篇手稿总结了我们的方法，以量化密集细胞体外细胞因子介导的细胞间通讯的程度。
【背景】哺乳动物的免疫系统已经发展到能够识别和限制潜在病原体的传播，同时使由免疫系统本身造成的附带组织损伤最小化。为了实现这一点，免疫细胞依赖细胞因子介质网络，这些细胞因子介质能够进行细胞间通讯并广播关于致病性侮辱的大小和性质的信息。大量不同细胞因子与其同源受体强烈结合，通常在纳摩尔或皮摩尔范围内具有特征性结合亲和力。通过细胞因子通讯产生免疫龛。例如，在骨髓和胸腺中，通过基质细胞分泌的白细胞介素-7（IL-7）分别支持增殖的B细胞和T细胞祖细胞的存活（Tokoyoda et al。， 2004; Alves等人，2009）。细胞因子生态位的大小控制成熟祖细胞的数量，从而保持血细胞区室平衡（Böyum，1968; ...
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