| RNA-protein UV-crosslinking Assay
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] RNA-protein interactions play a crucial role in every aspect of RNA metabolism, and also plays a major role in post-transcriptional gene regulation. RNA-binding proteins have been implicated in viral gene expression (Ray and Das, 2002) and microRNA-mediated gene regulation (Poria et al., 2016). Here we have described the protocol which (1) covalently links transiently interacting RNA-protein complexes by UV crosslinking, (2) removes the unprotected RNA by RNase digestion and (3) detects the RNA-protein complexes by SDS-PAGE analysis. This protocol provides a rapid and reliable means ...
[摘要] RNA-蛋白质的相互作用在RNA代谢的各个方面发挥着至关重要的作用，并且在转录后基因调控中起重要作用。 RNA结合蛋白涉及病毒基因表达（Ray和Das，2002）和微小RNA介导的基因调控（Poria等人，2016）。这里我们描述了（1）通过紫外线交联共价连接瞬时相互作用的RNA蛋白复合物的方案，（2）通过RNA酶消化去除未保护的RNA，（3）通过SDS-PAGE分析检测RNA-蛋白复合物。该方案提供了一种快速可靠的手段来直接测定RNA-蛋白质相互作用及其使用纯化蛋白质的动力学，也有助于鉴定新的RNA-蛋白质相互作用
背景 RNA-蛋白质相互作用由瞬时非共价相互作用介导，例如RNA和蛋白质分子中特异残基之间的静电相互作用和氢键。短波UV辐射可以诱导两个紧密放置的芳环之间的共价键形成。在蛋白质和核酸的含氮碱基中的几个氨基酸中发现芳环结构。因此，使用紫外线照射共价连接RNA和相互作用的蛋白质，从而可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析RNA蛋白复合物。该协议描述了一种简单快速的测定系统，可以在体外测定RNA-蛋白质相互作用及其结合动力学。此外，通过该方法获得的荧光标记的RNA-蛋白复合物的质谱分析可以导致新型RNA-蛋白质相互作用的鉴定。
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| Purification of Bacterial RNA from Infected Macrophages
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Author:
Date:
2015-11-20
[Abstract] Studying the transcriptome of bacterial pathogens during infection is a very informative and effective tool for discovering genes that contribute to successful infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging process due to the much higher amounts of host RNA in the lysates of infected cells. We have optimized a method for isolating RNA of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) bacteria infecting bone marrow derived macrophage cells (BMDM). After infection, we lyse the cells and filter the lysates through 0.45 µm filters to ...
[摘要] 在感染期间研究细菌病原体的转录组是一个非常有益的和有效的工具，用于发现有助于成功感染的基因。然而，从感染的细胞或组织中分离细菌RNA是一个挑战性的过程，因为感染细胞裂解物中宿主RNA的量高得多。我们已经优化了用于分离感染骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）的单核细胞增生性李斯特菌（（单核细胞增生李斯特氏菌）细菌）的RNA的方法。感染后，我们裂解细胞并通过0.45μm过滤器过滤裂解物以丢弃大多数宿主蛋白和RNA。接下来，我们重新悬浮细菌，并在DNase处理后提取RNA。提取的RNA适合于通过实时PCR或微阵列的基因表达分析。我们已经在我们对感染期间的单核细胞增生李斯特氏菌基因调节的体外研究中成功地采用了该方案（Lobel等人，2015; Lobel >，2012; Kaplan Zeevi等人，2013; Rabinovich等人，2012）。
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| Fluorescence in situ Hybridization to the Polytene Chromosomes of Anopheles Mosquitoes
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Author:
Date:
2013-08-20
[Abstract] Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a method that uses a fluorescently labeled DNA probe for mapping the position of a genetic element on chromosomes. A DNA probe is prepared by incorporating Cy-3 or Cy-5 labeled nucleotides into DNA by nick-translation or a random primed labeling method. This protocol was used to map genes (Sharakhova et al., 2010) and microsatellite markers (Kamali et al., 2011; Peery et al., 2011) on polytene chromosomes from ovarian nurse cells and salivary glands of malaria mosquitoes. Detailed physical genome mapping ...
[摘要] 荧光原位杂交（FISH）是一种使用荧光标记的DNA探针来绘制遗传元件在染色体上的位置的方法。 通过缺口翻译或随机引物标记法将Cy-3或Cy-5标记的核苷酸掺入DNA中来制备DNA探针。 该方案用于将基因（Sharakhova等人，2010）和微卫星标记物（Kamali等人，2011; Peery等人， >，2011）对来自卵巢保护细胞和疟疾蚊子的唾液腺的多角体染色体。 在多聚染色体上进行的详细的物理基因组作图具有将DNA序列连接到特异性染色体结构（例如异染色质）的潜力（Sharakhova等人，2010）。 该方法还允许比较细胞遗传学研究（Sharakhova等人，2011; Xia等人，2010）和物种系统发育的重建（Kamali等人， ，2012）。
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