| Preparation of Sequencing RNA Libraries through Chemical Cross-linking Coupled to Affinity Purification (cCLAP) in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes consisting of mRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) which control mRNA transcription localization, turnover, and translation. Some mRNAs within the mRNPs have been shown to undergo degradation or storage. Those transcripts can lack general mRNA elements, like the poly(A) tail or 5’ cap structure, which prevent their identification through the application of widely-used approaches like oligo(dT) purification. Here, we describe a modified cross-linking affinity purification protocol (cCLAP) based on existing cross-linking and immunoprecipitation ...
[摘要] 核糖核蛋白颗粒（mRNP）是由mRNA和RNA结合蛋白（RBP）组成的复合物，其控制mRNA转录定位，转换和翻译。已显示mRNP内的一些mRNA经历降解或储存。那些转录物可能缺乏一般的mRNA元件，如poly（A）尾或5'帽结构，这通过应用广泛使用的方法如oligo（dT）纯化来阻止它们的鉴定。在这里，我们描述了基于现有的交联和免疫沉淀（CLIP）方法的修饰的交联亲和纯化方案（cCLAP），以分离mRNP中可被去腺苷酸化，去除和/或部分降解的mRNA，从而开启了检测不同的可能性。非编码RNA（ncRNA）的类型。分离后，将RNA进行衔接子连接，然后进行下一代测序（NGS）。由于快速有效的交联和淬灭步骤，该方案也适用于瞬时诱导的mRNP颗粒。实例包括由外在应激物触发的处理体（PB）或应力颗粒（SG）。其重现性和广泛应用使该方案成为研究特定RNP的RNA组成的有用且有力的工具。
【背景】mRNP内转录物的表征对于理解细胞转录和转录后过程至关重要。通过交联和免疫沉淀，然后通过RNA-Seq从mRNP颗粒中分离RNA已经成为鉴定mRNA靶标的常用方法（Tagwerker et al。，2006; Hafner et al。，2010; Kishore et al。，2011）。 ...
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| Terminal Restriction Fragments (TRF) Method to Analyze Telomere Lengths
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Author:
Date:
2015-12-05
[Abstract] Chromosome ends - telomeres - are a focus of intensive research due to their importance for the maintenance of chromosome stability. Their shortening due to incomplete replication functions as a molecular clock counting the number of cell divisions, and ultimately results in cell-cycle arrest and cellular senescence. Determination of telomere lengths is an essential approach in telomere biology for research and diagnostic applications. Terminal Restriction Fragments (TRF) analysis is the oldest approach to analyze telomere lengths and remains the “gold standard” even in current studies. This ...
[摘要] 染色体末端 - 端粒是密集研究的焦点，因为它们对维持染色体稳定性的重要性。它们由于不完全复制而缩短作为计数细胞分裂数目的分子时钟，最终导致细胞周期停滞和细胞衰老。端粒长度的测定是端粒生物学中用于研究和诊断应用的基本方法。末端限制性片段（TRF）分析是分析端粒长度的最古老的方法，并且即使在目前的研究中仍然是"金标准"。该技术依赖于重复的小卫星端粒单元不含有限制酶的靶位点的事实。因此，端粒保持相对长的片段（TRF），而基因组DNA被消化成短片段。然后通过与放射性标记的端粒探针杂交显现端粒DNA的片段。由于TRF除了端粒外还包括直到第一限制性位点的端粒相关DNA的短区域，结果稍微偏向更高的TRF值。因此，建议使用频繁的刀具或其混合物，以尽量减少这种差异。此外，通过使用TRF分析，可以区分真正（末端）端粒与间质端粒重复（ITR）（Richards和Ausubel，1988）。在该方法中，首先将BAL31消化应用于高分子量DNA。酶从其末端逐渐降解线性DNA。然后用一种或多种限制酶消化降解的DNA，并通过凝胶电泳分离片段。印迹后，用末端标记序列或端粒序列探测膜。真正的TRF可以区别于ITR，因为它们随着BAL31消化时间的增加而逐步缩短，而ITR是BAL31抗性的。在时间零时的TRF BAL31消化模式表示近似端粒长度（Fajkus等人，2005）。
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| In vitro Transcription (IVT) and tRNA Binding Assay
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Author:
Date:
2014-09-20
[Abstract] This protocol describes the coupling of (i) “live” in vitro RNA transcription with (ii) binding by a radiolabeled, pre-formed tRNA followed by native gel electrophoresis and phosphorimager scan to visualize the complex. The necessity arose from the stable structure that one RNA forms in the absence of its interaction partner. The T-box leader RNA, a transcription control system, folds into a thermodynamically very stable stem-loop structure without the tRNA present, which makes in vitro binding interaction of both pre-formed RNAs very difficult. I therefore adjusted the ...
[摘要] 该方案描述了（i）"活"体外RNA转录与（ii）通过放射性标记的预先形成的tRNA的结合，然后是天然凝胶电泳和磷光成像仪扫描以显现复合物的偶联。 必要性来自一种RNA在不存在其相互作用配偶体时形成的稳定结构。 T盒前导RNA，转录控制系统，折叠成热力学非常稳定的茎 - 环结构，没有tRNA存在，这使得体外结合两个预先形成的RNA的相互作用非常困难。 因此，我调整结合测定以模拟细菌细胞中的"天然"情况，其中预先形成的稳定的tRNA已经存在，而T盒前导RNA被RNA聚合酶主动转录。 方案的第一部分还描述了体外转录和tRNA的标记。
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