Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) for Studying Sarcomeric Protein Interactions in Drosophila
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Date:
2020-04-05
[Abstract] Protein-protein interactions in Drosophila myofibrils are essential for their function and formation. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an effective method for studying protein interactions and localization. BiFC relies on the reconstitution of a monomeric fluorescent protein from two half-fragments when in proximity. Two proteins tagged with the different half-fragments emit a fluorescent signal when they are in physical contact, thus revealing a protein interaction and its spatial distribution. Because myofibrils are large networks of interconnected proteins, BIFC ...
[摘要] [摘要] 果蝇肌原纤维中的蛋白质-蛋白质相互作用对其功能和形成至关重要。双分子荧光互补(BiFC )是研究蛋白质相互作用和定位的一种有效方法。BiFC 依赖于邻近时从两个半片段重构单体荧光蛋白。标记有不同半片段的两种蛋白质在物理接触时会发出荧光信号,从而揭示了蛋白质相互作用及其空间分布。因为肌原纤维相互连接的蛋白质的大型网络中,附设是一种理想的方法来 研究肌原纤维中蛋白质之间的相互作用。在这里,我们提出了一种生成与BiFC 兼容的转基因果蝇的协议,以及一种基于肌原纤维中荧光BiFC 信号的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法。我们的方案适用于大多数果蝇蛋白,只需稍加修改即可用于研究任何组织。
[背景] 肉瘤是横纹肌中最小的收缩单位,并沿着肌原纤维的长度以重复的方式延伸(Reedy和Beall,1993)。肉瘤产生肌肉收缩的能力取决于两个肌原纤维成分:细丝和粗丝。肌球蛋白粗丝固定在肌节中心的M线,而肌动蛋白细丝固定在肌节两侧的Z盘上。因此,Z盘对于维持肌原纤维的结构和收缩至关重要,而Z盘无法形成可能导致各种人类肌病的严重缺陷性肌肉表型(Lemke和Schnorrer,2017年)。
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Preparation of Sequencing RNA Libraries through Chemical Cross-linking Coupled to Affinity Purification (cCLAP) in Saccharomyces cerevisiae
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Date:
2018-10-05
[Abstract] Ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes consisting of mRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) which control mRNA transcription localization, turnover, and translation. Some mRNAs within the mRNPs have been shown to undergo degradation or storage. Those transcripts can lack general mRNA elements, like the poly(A) tail or 5’ cap structure, which prevent their identification through the application of widely-used approaches like oligo(dT) purification. Here, we describe a modified cross-linking affinity purification protocol (cCLAP) based on existing cross-linking and immunoprecipitation ...
[摘要] 核糖核蛋白颗粒(mRNP)是由mRNA和RNA结合蛋白(RBP)组成的复合物,其控制mRNA转录定位,转换和翻译。已显示mRNP内的一些mRNA经历降解或储存。那些转录物可能缺乏一般的mRNA元件,如poly(A)尾或5'帽结构,这通过应用广泛使用的方法如oligo(dT)纯化来阻止它们的鉴定。在这里,我们描述了基于现有的交联和免疫沉淀(CLIP)方法的修饰的交联亲和纯化方案(cCLAP),以分离mRNP中可被去腺苷酸化,去除和/或部分降解的mRNA,从而开启了检测不同的可能性。非编码RNA(ncRNA)的类型。分离后,将RNA进行衔接子连接,然后进行下一代测序(NGS)。由于快速有效的交联和淬灭步骤,该方案也适用于瞬时诱导的mRNP颗粒。实例包括由外在应激物触发的处理体(PB)或应力颗粒(SG)。其重现性和广泛应用使该方案成为研究特定RNP的RNA组成的有用且有力的工具。 【背景】mRNP内转录物的表征对于理解细胞转录和转录后过程至关重要。通过交联和免疫沉淀,然后通过RNA-Seq从mRNP颗粒中分离RNA已经成为鉴定mRNA靶标的常用方法(Tagwerker et al。,2006; Hafner et al。,2010; Kishore et al。,2011)。 ...
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Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the ...
[摘要] 该协议提供了分步说明(图1),用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a(以前称为Cpf1)。 它还包括一个高纯度纯化方案,并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化,并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a(FnCas12a)的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA(crRNA)作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护(van der Oost等人,2014; Marraffini ,2015)。 1类CRISPR-Cas系统(包含I型,III型和IV型)通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物,而2类系统(包含II型,V型和VI型)依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰(Mohanraju et al。 2016年)。
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