| Expression and Purification of Functionally Active Serotonin 5-HT2A Receptor in Insect Cells Using Low-titer Viral Stock
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Date:
2020-08-05
[Abstract] The serotonin 5-HT2A receptor (5-HT2AR) is a member of the GPCR family that is important for various neurological functions and whose dysregulation causes many mental health disorders. Structural investigations of 5-HT2AR require the production of functionally active receptors expressed from eukaryotic cell cultures. In this protocol, we describe a step-by-step method to express and purify serotonin 5-HT2AR using a baculoviral expression vector system in Sf9 cell cultures, derived from our work with the rat (matching Uniprot ID P14842) and human ...
[摘要] [摘要] 血清素5-HT2A受体（5-HT2AR）是GPCR家族的一员，对多种神经功能起重要作用，其调节失调会导致许多心理健康障碍。5-HT2AR的结构研究需要从真核细胞培养物中产生功能活性受体。在本方案中，我们描述了一种在Sf9细胞培养中使用杆状病毒表达载体系统表达和纯化血清素5-HT2AR的分步方法，该方法来源于我们对大鼠（匹配Uniprot ID P14842）和人类（匹配Uniprot ID P28223）5-HT2AR的研究。这种方法的一个独特的特点是使用细胞培养添加剂以低感染倍数感染细胞，从而使用比不使用添加剂的先前方法少几倍的病毒滴度。该方案可以通过改变感染后收获时间来选择性地过度表达糖基化或非糖基化形式的受体。
[背景]在过去十年中，由于功能活性受体高产表达方法的发展，对GPCRs的结构研究激增（Granier和Kobilka，2012）。其中，5-羟色胺GPCRs是一组小而多样的受体，在神经调节中起着重要作用，它们的功能障碍与许多心理健康障碍有关（Berger等人，2009）。在利用真核宿主进行蛋白质表达的多种方法中，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，利用Sf9细胞结合杆状病毒表达系统表达GPCRs因其高产率和可靠性而成为一个突出的方法（Saarenpaa等人，2015年；Wiseman等人，2020年）。然而，各种方法不断发展，以克服现有方法的各种缺点。目前还没有一种统一的、单一的方法来表达所有类型的GPCRs，并没有足够高的产率来进行结构研究。这在一定程度上是由于这些受体的多样性，以及它们的序列需要修改，以使晶体学研究成为可能。单电子显微镜的出现对电子显微镜的研究提出了更高的要求。利用昆虫细胞中杆状病毒表达的现有方法的一个关键要求是获得高滴度的病毒储备，这在许多情况下是非常重要的。此外，对于蛋白质的生产，感染细胞通常在感染的多样性~1-5，需要使用大量的病毒滴度，而病毒滴度会随着时间的推移而耗尽。使用多个批次的病毒滴度可以增加批次间的变异性。因此，强烈需要消耗更少病毒滴度的方法。此外，许多GPCRs的天然形式，包括5-羟色胺受体，具有广泛的糖基化，这不是所有情况下都需要的。因此，任何能够提供主要糖基化或非糖基化形式受体的方法，优选地通过简单改变方案，也是可取的。在这里，我们描述了一种在Sf9细胞中使用杆状病毒表达系统表达和纯化5-HT2AR的方法，与现有方法相比，该方法需要最少的病毒滴度，并且可以通过改变感染后收获时间来选择糖基化程度。该方案基于先前的工作（Wacker等人，2013；Mahesh等人，2018；Mozumder等人，2020），已经标准化，以制备用于高分辨率低温组织结构测定的样品，并且适用于采用类似表达和纯化策略的其他GPCR、膜蛋白和其他可溶性蛋白质。 ...
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| Obtaining Multi-electrode Array Recordings from Human Induced Pluripotent Stem Cell–Derived Neurons
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Date:
2017-11-20
[Abstract] Neuronal electrical properties are often aberrant in neurological disorders. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)-derived neurons represent a useful platform for neurological disease modeling, drug discovery and toxicity screening in vitro. Multi-electrode array (MEA) systems offer a non-invasive and label-free platform to record neuronal evoked-responses concurrently from multiple electrodes. To better detect the neural network changes, we used the Axion Maestro MEA platform to assess neuronal activity and bursting behaviors in hiPSC-derived neuronal cultures. Here we ...
[摘要] 神经元电特性在神经疾病中经常是异常的。 人诱导的多能干细胞（hiPSC）衍生的神经元代表神经疾病建模，药物发现和体外毒性筛选的有用平台。 多电极阵列（MEA）系统提供了一个非侵入性的无标记平台，可同时记录来自多个电极的神经元诱发反应。 为了更好地检测神经网络变化，我们使用了Axion Maestro MEA平台来评估hiPSC衍生的神经元培养物中的神经元活动和爆裂行为。 在这里，我们描述了神经元培养准备，MEA记录和数据分析的详细方案，我们希望这将有益于该领域的其他研究人员。
【背景】人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术目前正用于体外模拟神经和精神疾病。最近的研究已经证明，与特定疾病有关的某些细胞表型可以在盘中重现。神经电活动是神经系统功能的本质，代表了正常功能对于情绪，记忆，感觉形态和体内行为至关重要的交流的关键形式。在疾病状况下，电特性可能受到影响，因此了解基于hiPSC的神经疾病模型中的神经元电路连接性，生理学和病理学非常重要。
膜片钳和多电极阵列（MEA）技术是用于评估电生理学活性并由此评估神经元功能的主要技术。尽管膜片钳是研究单个细胞的活性和功能的强大的细胞内方法（Neher等人，1978），MEA平板具有记录细胞外动作电位（或尖峰）的能力，和同一板中数千个不同细胞同时的局部场电位，从而更好地理解网络水平的神经元活动（Hutzler等人，2006; ...
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| [3H]-Spiperone Competition Binding to Dopamine D2, D3 and D4 Receptors
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2013-10-20
[Abstract] This protocol is intended for use in 96 well plates (1,200 μl wells) but it can similarly be applied to standard test tubes (Levant, 2007). D2, D3, and D4 dopamine receptors are members of the D2-like class of dopamine receptors. They can be studied using the radioligand [3H]-spiperone, which is an antagonist binding to D2, D3, and D4 receptors with comparable affinity. A competition experiment is usually performed to determine the affinity of a compound for a receptor. If multiple subtypes or states of ...
[摘要] 该方案旨在用于96孔板（1,200μl孔），但它可以类似地应用于标准试管（Levant，2007）。 D 2，D 3和D 4多巴胺受体是D 2 S 2类多巴胺受体的成员受体。可以使用放射性配体[3 H] - 螺哌隆来研究它们，所述放射性配体是结合D 2，D 3和D 3的拮抗剂， 4>受体。通常进行竞争实验以确定化合物对受体的亲和力。如果存在受体的多种亚型或状态，并且竞争性化合物使它们分化，则竞争结合实验可以量化两种亚型或状态的相对贡献;而在两个以上亚型或状态的分辨率在理论上是可能的，在实际中它几乎是不可行的。因此，在各种浓度的未标记的目的化合物的存在下，定量放射性配体与受体的结合。在竞争研究中放射性配体的浓度应当是在饱和结合中测定的约2-3的K d值;这将允许受体的充分占据以获得强信号，并且同时避免由于高放射性配体浓度而使竞争变得太难。选择孵育时间和温度以允许与放射性配体和竞争剂的受体的缔合和解离之间形成平衡。值得注意的是，简单的竞争实验不一定证明未标记的药物和受体之间的相互作用的竞争性。如果相对于放射性配体的亲和力（<1nm），比放射性低（氚化），则需要高测定体积（≥1ml）以避免配体消耗;如果使用具有高表达密度的受体来源（例如表达的重组受体），这是特别重要的。所需竞争剂浓度的数量取决于实验的目标。如果仅需要对拮抗剂效力的粗略估计，则每个对数增量1-2个浓度就足够了。然而，如果目的是测试受体的可能亚型或状态，则需要每个对数增量3-5个浓度。如果可能，测定中最低的竞争剂浓度不应引起任何可检测的抑制，而最高浓度应完全消除特异性结合。每个实验可以分为不同的步骤，如测定制备，膜制备，温育，过滤，样品计数和数据分析。为了使实验误差最小化，所有测定至少一式两份进行。另外，总结合和非特异性结合的重复应包括在测定中;用于定义非特异性结合（nsb）的试剂应当是与放射性配体不同的化学（不同的家族）和物理上（避免两种亲脂性化合物的组合），以避免伪像。对于所选择的测定条件的具体益处的讨论参见van wieringen等人（2013）（拷贝可以从作者获得）。
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