| Quantitative Live-cell Reporter Assay for Noncanonical Wnt Activity
|
|
Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Noncanonical Wnt signaling functions independently of the β-catenin pathway to control diverse developmental processes, and dysfunction of the pathway contributes to a number of human pathological conditions, including birth defects and metastatic cancer. Progress in the field, however, has been hampered by the scarcity of functional assays for measuring noncanonical Wnt signaling activity. We recently described the Wnt5a-Ror-Kif26b (WRK) reporter assay, which directly monitors a post-transcriptional regulatory event in noncanonical Wnt signaling. In this protocol, we describe the generation ...
[摘要] 非经典Wnt信号独立于β-catenin途径发挥功能来控制不同的发育过程，并且该途径的功能障碍导致许多人类病理状况，包括出生缺陷和转移性癌症。 然而，该领域的进展一直受到用于测量非典型Wnt信号活性的功能测定的稀缺性的阻碍。 我们最近描述了Wnt5a-Ror-Kif26b（WRK）记者测定法，其直接监测非典型Wnt信号传导中的转录后调节事件。 在该协议中，我们描述了通过流式细胞术检测和测量活细胞中Wnt5a信号传导活性的稳定GFP-Kif26b报告细胞系和定量记者测定法的产生。
【背景】从历史上看，转录报告基因检测方法促进了主要信号通路的描述。具体来说，β-连环蛋白依赖性萤光素酶或基于GFP的转录报道基因有助于阐明经典Wnt /β-连环蛋白途径的分子机制（Korinek et al。，1997; Fuerer and Nusse，2010）。尽管已经描述了许多基于JNK依赖性转录的非经典Wnt信号传导报道分子，但是这些转录应答是否是非经典Wnt信号传导的主要或次要仍不清楚（Veeman等，2003; Nishita等，等，2010; Ohkawara和Niehrs，2011）。此外，用于实时检测非转录性Wnt5a-Ror信号传导事件的记者尚未获得。 ...
|
|
|
| Adoptive Transfer of Lung Antigen Presenting Cells
|
|
Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Our protocol describes adoptive transfer of antigen presenting cells (APCs) isolated from the lungs by enzymatic digestion and magnetic enrichment. This protocol can be used to study APC functions and trafficking.
[摘要] 我们的方案描述了通过酶消化和磁力富集从肺分离的抗原呈递细胞（APC）的过继转移。该协议可用于研究APC功能和贩运。
背景 包括巨噬细胞和树突状细胞（DC）在内的肺癌APC在感染侵袭性病原体，引发T细胞应答和控制耐受性反应中发挥关键作用。肺DC是稳定状态下最有效的专业APC，包括常规DC（cDC）和浆细胞样DC（pDC），以及炎症时新招募的单核细胞衍生的DC（moDC）（Kopf等人）。 ，2015）。肺静脉巨噬细胞，包括肺泡巨噬细胞，间质巨噬细胞和支气管巨噬细胞，在呈递抗原方面的效力较低。
＆nbsp;所有巨噬细胞和cDC在其细胞表面表达高水平的CD11c，而pDC表达中等水平的CD11c（Becher等，2014）。因此，CD11c磁性微珠可用于分离小鼠肺巨噬细胞和cDC。我们开发了一种从正常小鼠中分离肺APCs的方案，然后将其过渡转移到同基因骨髓移植小鼠。我们使用该方案来确定正常的肺APCs是否足以恢复移植后疱疹病毒感染的T辅助细胞极化（Zhou等人，2016）。
|
|
|
| Immunoplaque Assay (Influenza Virus)
|
|
Author:
Date:
2013-11-05
[Abstract] Despite developed long time ago, plaque assay is still the gold standard for viral titer quantification in modern virology. The standard crystal violet-based plaque assay relies on virus’ ability to induce cytopathic effect (CPE) which limits the assay to lytic viruses. Alternative viral quantification assays such as 50% tissue culture infectious assay (TCID50) and genetic material quantification by Q-PCR provide a different way of viral quantification with their own shortcoming. In here, we modified the fluorescent focus assay and developed an antibody-based immunoplaque assay ...
[摘要] 尽管发展很久以前，斑块测定仍然是现代病毒学病毒滴度量化的黄金标准。 标准的基于结晶紫的斑块测定依赖于病毒诱导细胞病变效应（CPE）的能力，其限制了对裂解病毒的测定。 替代性病毒定量测定如50％组织培养感染测定（TCID 50）和通过Q-PCR的遗传物质定量提供了具有其自身缺点的病毒定量的不同方式。 在这里，我们修改荧光焦点测定和开发基于抗体的免疫斑检测提供可靠和可重复的病毒定量独立于CPE。 我们的测定不仅允许病毒滴度的精确测定，而且提供关于病毒动力学，遗传稳定性和病毒种群的纯度的信息。
|
|
|