| Quantification of Starch in Guard Cells of Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] In this protocol, we describe how to quantify starch in guard cells of Arabidopsis thaliana using the fluorophore propidium iodide and confocal laser scanning microscopy. This simple method enables monitoring, with unprecedented resolution, the dynamics of starch in guard cells.
[摘要] 在该方案中，我们描述了如何使用荧光团碘化丙啶和共聚焦激光扫描显微镜来量化拟南芥保卫细胞中的淀粉。 这种简单的方法能够以前所未有的分辨率监测保卫细胞中淀粉的动态变化。
【背景】淀粉是葡萄糖的复合聚合物，代表植物储存碳水化合物的最丰富形式。淀粉根据其衍生的细胞类型和外部环境条件提供不同的功能。在控制水和二氧化碳与环境交换的气孔中边界的保卫细胞中，淀粉可在转变为光的几分钟内动员，有助于产生有机酸和糖，从而增加保卫细胞膨胀并促进气孔开放。在叶肉细胞中，淀粉通常在白天逐渐积累，并在夜间降解以支持代谢（Santelia和Lunn，2017）。
因为保卫细胞仅占总叶的一小部分，所以难以使用常规方法定量测量淀粉。到目前为止，保卫细胞中的淀粉积累主要通过碘染色显现。该技术可以确定淀粉的存在/不存在，但不能提供准确的定量信息。
在这里，我们描述了一种基于荧光的成像方法来量化拟南芥保护细胞中的淀粉。该技术基于细胞壁材料和其他葡聚糖底物（包括淀粉）与荧光假席夫试剂碘化丙啶（PS-PI）的共价标记。用高碘酸处理分离的表皮，以将葡萄糖单元的羟基氧化成醛和酮基团。然后醛基（-CHO）可以与碘化丙锭共价反应，产生具有高荧光葡聚糖的样品，非常适合于共聚焦激光扫描显微镜。保卫细胞叶绿体中单个淀粉颗粒的面积可以使用数字成像来确定。我们应用这种方法来评估完整的拟南芥叶片的保护细胞中的淀粉含量在昼夜循环中的动态变化，并确定fusicoccin（质子泵的化学活化剂）对淀粉量的影响。分离表皮的保卫细胞剥离漂浮在气孔开放缓冲液中的碎片（Horrer ...
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| Subchromoplast Fractionation Protocol for Different Solanaceae Fruit Species
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2016-07-05
[Abstract] Macromolecules, proteins, lipids, and other small molecules, such as carotenoids can be studied within different tissues and organelles using an array of in vitro and in vivo methodologies. In the case of tomato and other fleshy fruit the predominant organelle in ripe fruit is the chromoplast. The characteristic feature of this organelle is the presence of pigments, carotenoids at high levels. In order to fully understand the underlying biological mechanisms that operate within the chromoplast, it is necessary to perform studies at the subchromoplast level. This protocol ...
[摘要] 可以使用体外和体内方法的阵列在不同的组织和细胞器中研究大分子，蛋白质，脂质和其它小分子，例如类胡萝卜素。在番茄和其他肉果的情况下，成熟果实中的主要细胞器是色质体。这种细胞器的特征是存在高水平的颜料，类胡萝卜素。为了完全理解在chromoplast内操作的基本生物机制，有必要在subchromoplast水平进行研究。该方案允许通过蔗糖梯度分离塑料球（脂蛋白颗粒，其与叶绿体中的类囊体膜偶联）和膜（类囊体，包膜样）的色原体。然后可以独立地分析亚氯化银色室。突变体/转基因基因型与其背景之间的比较可以在同一分馏运行期间同时进行精确进行。该程序最初是为了成熟番茄果实开发的，但已经显示翻译成甜和辣椒。
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| Separation and Detection of Phosphorylated and Nonphosphorylated BvgA, a Bordetella pertussis Response Regulator, in vivo and in vitro
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Author:
Date:
2013-11-20
[Abstract] Protein phosphorylation plays a central role in signal transduction in bacteria. However, separation and detection of the phosphorylated protein from its nonphosphorylated form remain challenging. Here we describe a method to detect phosphorylation of the Bordetella pertussis response regulator BvgA, which is phosphorylated at an aspartate residue (Boulanger et al., 2013). This method is based on the proprietary adduct, Phos-tagTM, a dinuclear metal complex, which together with Zn2+ or Mn2+, forms a complex with a phosphomonoesterdianion, ...
[摘要] 蛋白质磷酸化在细菌的信号转导中起着中心作用。然而，从其非磷酸化形式分离和检测磷酸化蛋白仍然是挑战性的。在这里我们描述了检测百日咳博德特氏菌响应调节剂BvgA的磷酸化的方法，其在天冬氨酸残基被磷酸化（Boulanger等人，2013）。该方法基于专有的加合物Phos-tag TM sup/TM，其是双核金属络合物，其与Zn 2+或Mn 2+反应， ，与磷酸二酯酶形成复合物，例如应答调节剂的磷酸化天冬氨酸（Barbieri和Stock，2008; Kinoshita和Kinoshita-Kikuta，2011）。对于体内检测，在4℃下在轻度甲酸中裂解百日咳细胞以使磷酸 - 天冬氨酸键的破坏最小化，并且通过包含Phos标签的电泳（SDS-PAGE）将磷酸化的BvgA从其非磷酸化形式分离> TM 。随后通过蛋白质印迹分析检测两种形式的BvgA。还容易实现在体外用乙酰磷酸盐处理后形成的磷酸化BvgA的水平的量化。因此，该技术允许容易地评估B中BvgA磷酸化的水平。百日咳和 。大肠杆菌在不同实验室条件下在体内或在不同反应条件下在体外磷酸化后（本研究部分由NIH的Intramural Research Programme支持， NIDDK）。
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