| Filter Retardation Assay for Detecting and Quantifying Polyglutamine Aggregates Using Caenorhabditis elegans Lysates
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Protein aggregation is a hallmark of several neurodegenerative diseases and is associated with impaired protein homeostasis. This imbalance is caused by the loss of the protein’s native conformation, which ultimately results in its aggregation or abnormal localization within the cell. Using a C. elegans model of polyglutamine diseases, we describe in detail the filter retardation assay, a method that captures protein aggregates in a cellulose acetate membrane and allows its detection and quantification by immunoblotting.
[摘要] 蛋白质聚集是几种神经退行性疾病的标志，并且与蛋白质体内平衡受损有关。 这种不平衡是由蛋白质天然构象的丧失引起的，最终导致其在细胞内聚集或异常定位。 使用 C。 线虫聚谷氨酰胺疾病模型，我们详细描述了过滤阻滞测定，一种捕获醋酸纤维素膜中蛋白质聚集体的方法，并允许通过免疫印迹进行检测和定量。
【背景】帕金森氏症，阿尔茨海默氏症和多聚谷氨酰胺疾病等神经退行性疾病的一个病理特征是在大脑不同区域存在蛋白质聚集物（Soto，2003; Stroo et al。，2017）。在多谷氨酰胺疾病的情况下，编码序列中谷氨酰胺（CAG）重复的异常扩增扰乱了蛋白质的天然折叠。结果，错误折叠的蛋白质暴露其氨基酸序列的区域，这使得它易于与其他蛋白质聚集，形成大的，不溶的聚集体，这可能妨碍正常的细胞功能（综述于Kuiper 等人 ，2017）。
已经开发了几种用于检测不溶性蛋白质聚集体的方法，包括例如染料结合测定（例如，硫磺素T，刚果红，NIAD-4）和电子显微镜检查。过滤阻滞测定是一种快速而灵敏的方法，可检测和定量体内和体外形成的蛋白质聚集体，包括聚谷氨酰胺（Scherzinger et al。 ，1997; Wanker et al。，1999），α-突触核蛋白（Recasens et al。，2018），和amyloid-beta聚集体（Bieschke et ...
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| In vitro Analysis of Ubiquitin-like Protein Modification in Archaea
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ubiquitin-like (Ubl) protein is widely distributed in Archaea and involved in many cellular pathways. A well-established method to reconstitute archaeal Ubl protein conjugation in vitro is important to better understand the process of archaeal Ubl protein modification. This protocol describes the in vitro reconstitution of Ubl protein modification and following analysis of this modification in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon serving as the model organism.
[摘要] 泛素样（Ubl）蛋白广泛分布于古细菌中并参与许多细胞途径。 为了更好地理解古细菌Ub1蛋白质修饰的过程，重建体外古细菌Ubl蛋白质缀合物的完善方法是很重要的。 该协议描述了Ubl蛋白质修饰的体外重建以及在作为模型生物的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中对这种修饰进行分析。
【背景】泛素（Ub）与靶蛋白共价连接的过程被称为泛素化，其控制真核细胞中大量的细胞过程（Glickman和Ciechanover，2002; Komander和Rape，2012）。遍在蛋白化由一系列酶（包括Ub激活酶（E1），Ub结合酶（E2s）和Ub连接酶（E3s））催化。泛素化的体外重建是确定酶之间或E3与蛋白质底物之间特异性的有用测定法（Zhao等人，2012）。在古细菌中，Ubl蛋白SAMP采用Ub折叠，并且与E1样酶UbaA催化的蛋白靶标异肽连接[Maupin-Furlow，（2014）综述]。尽管E1同系物在古细菌中广泛存在，但基于一级序列比较，在大多数古细菌中未预测经典E2或E3酶。我们最近对Haloferax volcanii的研究表明甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）是Ubl蛋白质修饰（sampylation）与UbaA一起在体内温和的氧化条件下和< （体外）（fu="">
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| An Improved Method for Measuring Chromatin-binding Dynamics Using Time-dependent Formaldehyde Crosslinking
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Formaldehyde crosslinking is widely used in combination with chromatin immunoprecipitation (ChIP) to measure the locations along DNA and relative levels of transcription factor (TF)-DNA interactions in vivo. However, the measurements that are typically made do not provide unambiguous information about the dynamic properties of these interactions. We have developed a method to estimate binding kinetic parameters from time-dependent formaldehyde crosslinking data, called crosslinking kinetics (CLK) analysis. Cultures of yeast cells are crosslinked with formaldehyde for various periods ...
[摘要] 甲醛交联广泛用于与染色质免疫沉淀（ChIP）相结合来测量沿着DNA的相对位置以及转录因子（TF）-DNA相互作用的体内相对水平。但是，通常所做的测量不能提供关于这些交互的动态属性的明确信息。我们已经开发了一种方法来评估来自时间依赖性甲醛交联数据的结合动力学参数，称为交联动力学（CLK）分析。酵母细胞的培养物与甲醛交联不同的时间段，在特定位点产生相对的ChIP信号。我们使用质量作用CLK模型来拟合数据，以提取TF-染色质相互作用的动力学参数，包括开关速率和交联速率。从停车费和停车费中我们可以获得停车和停车时间。以下方案是该方法的第二次迭代，CLKv2，更新了改进的交联和淬火条件，更多关于交联速率的信息以及对观察到的动力学模型建模的系统程序。已应用CLKv2分析来研究TATA结合蛋白（TBP）和其他TF的选定子集的结合行为。该协议使用酵母细胞开发，但也可适用于来自其他生物体的细胞。
【背景】转录起始是一个复杂的过程，涉及染色质化启动子上数十种蛋白的协作和协调相互作用（Kim等人，2005; Encode Consortium，2012; Rhee等人， ，2012; Dowen等人，2014年）。许多研究已经研究了体外核心转录机器的组装和调控（Zawel和Reinberg，1992; Conaway和Conaway，1993; Roeder，1996; ...
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