| Ex vivo Ooplasmic Extract from Developing Drosophila Oocytes for Quantitative TIRF Microscopy Analysis
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Understanding the dynamic behavior and the continuously changing composition of macromolecular complexes, subcellular structures and organelles is one of areas of active research in both cell and developmental biology, as these changes directly relate to function and subsequently to the development and homeostasis of the organism. Here, we demonstrate the use of the developing Drosophila oocyte to study dynamics of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) with high spatiotemporal resolution. The combination of Drosophila genetics with total internal reflection (TIRF) ...
[摘要] 了解大分子复合物，亚细胞结构和细胞器的动态行为和不断变化的组成是细胞和发育生物学中积极研究的领域之一，因为这些变化与功能和随后的生物体的发育和稳态直接相关。 在这里，我们演示了使用发展中的果蝇卵母细胞来研究具有高时空分辨率的信使核糖核蛋白复合物（mRNPs）的动力学。 果蝇的遗传学与全内反射（TIRF）显微镜，图像处理和数据分析结合，以前所未有的精确度了解了mRNP的运动性和组成动力学。
【背景】细胞内运输是活细胞的基本过程之一。几乎细胞内的所有细胞 - 离子，分子，复合物，细胞器 - 被积极地传输，使局部熵减少。尽管近年来，我们对这些运输过程的机理有了很大的了解，但我们的大部分知识来自于体外和细胞培养研究。在这些简化的系统中，很难确定是否利用运输监管流程的全部潜力。另一方面，组织，器官，组织和生物体通常太复杂，无法有效地研究时空分辨率，足以匹配这些运输过程的规模。为了结合自下而上和自上而下的方法的优点，已经开发了在保持复杂性的同时，使这些过程更易于访问的技术。一个例子是从ambiphian（例如，非洲爪蟾）卵母细胞和胚胎中制备大量细胞质提取物来研究细胞分裂（Lohka和Masui，1983; Murray，1991; Sawin和Mitchison，1991）。我们最近显示，在细胞质液滴 - ...
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| Binding Assay of Cytosolic Proteins to the Cytoskeleton
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Author:
Date:
2013-11-20
[Abstract] Many cellular proteins interact with the cytoskeleton (both actin filaments and microtubules), either dynamically or permanently. This interaction is required during different aspects of the cell life, for example during the process of cell division. In addition, many enzymes interact transiently with actin filaments and microtubules in order to promote their cellular distribution. Several substances with inhibitory capacity can affect this binding and cause damages to cells. This protocol allows to analyze whether a protein interacts with either actin filaments or microtubules and, when ...
[摘要] 许多细胞蛋白质与细胞骨架（肌动蛋白丝和微管）相互作用，动态或永久。这种相互作用在细胞生命的不同方面是需要的，例如在细胞分裂过程中。此外，许多酶与肌动蛋白丝和微管瞬时相互作用以促进它们的细胞分布。几种具有抑制能力的物质可以影响这种结合并对细胞造成损害。这个协议允许分析蛋白质是否与肌动蛋白丝或微管相互作用，以及在适用时，控制这种相互作用的条件。该测试基于目标蛋白和细胞骨架丝之间的特异性结合。如实施例图示（见下文）所示，测试从细胞裂解物开始，向其中加入肌动蛋白丝（由单体肌动蛋白产生）。然后孵育混合物（在由操作者选择的不同实验条件下进行），使得感兴趣的蛋白质（在实施例中，肌球蛋白）与肌动蛋白丝结合。然后将样品离心以从肌动蛋白丝分离未结合或弱结合的蛋白质，感兴趣的蛋白质和最终痕量较少特异性的蛋白质与其结合。
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