| Gliding Assay to Analyze Microtubule-based Motor Protein Dynamics
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The purpose of this protocol is to provide an updated method of performing microtubule gliding assays and visualizing it using fluorescence microscopy.
[摘要] 该协议的目的是提供一种更新的微管滑翔测定方法，并使用荧光显微镜对其进行可视化。
有丝分裂主轴是主导有丝分裂的蛋白质机械。有丝分裂纺锤体利用基于微管的运动蛋白来组织自身，并施加力量驱动细胞分裂。基于微管的运动蛋白使用源自ATP水解的能量产生机械工作（Coppin等人，1997）。运动蛋白以单向方式转移微管。运动的行为可以通过体外滑行测定（Tao和Scholey，2010）来观察，其中将电机固定在玻璃表面上并提供微管和ATP。然后可以使用荧光显微镜研究运动蛋白的运动性，并且可以实时观察其动态行为的细节。该更新的方案将允许使用体外微管滑动测定法（Tao等人，2006和2016）分析基于微管的运动蛋白功能。
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| In vitro Microtubule Bundling Assay under Physiological Conditions
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Kinesins play a role in organizing the mitotic spindle through the crosslinking of microtubules (MTs), made possible through binding sites at opposite ends of the holoenzyme. Here, we developed a method to test kinesin MT crosslinking action under physiological conditions.
[摘要] 驱动蛋白通过微管（MT）的交联来组织有丝分裂纺锤体，通过在全酶的相对端的结合位点成为可能。在这里，我们开发了一种在生理条件下测试驱动蛋白MT交联作用的方法。
基于微管的运动蛋白是重要的，因为它们使用ATP的化学能产生力以便向量转移微管（MT）。在这些基于MT的运动蛋白中，称为驱动蛋白的超家族负责定向运输和沿微管的运动。一些运动蛋白在全酶的两端具有MT结合位点，因此它们可以在生理ATP条件下将MT交联成束（Tao等人，2006）。由于这种捆绑活动，它们在组织和维持有丝分裂纺锤体方面具有重要作用，其主要作用取决于其微管的极性模式（van den Wildenberg等人，2008）。以前的捆绑测定不包括ATP，或者使用可以产生人为结果的不可水解的ATP类似物。这里我们开发了一种使用生理ATP条件的方法。通过纯化这些全长运动蛋白，它使我们能够在生理条件下测定其交联活性。
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| In vitro Microtubule Binding Assay and Dissociation Constant Estimation
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Author:
Date:
2016-03-20
[Abstract] Microtubules (MTs) support an astonishing set of versatile cellular functions ranging from cell division, vesicle transport, and cell and tissue morphogenesis in various organisms. This versatility is in large mediated by MT-associated proteins (MAPs). The neuronal MAP Tau, for example, is stabilizing MTs in axons of the vertebrate nervous system and thus provides the basis for enduring axonal transport and the long life span of neurons (Mandelkow et al., 1994). Tau has been shown to bind to MTs directly in vitro and also to promote their nucleation from α-/β-tubulin ...
[摘要] 微管（MT）支持惊人的一套多功能细胞功能，从细胞分裂，囊泡运输，以及细胞和组织形态发生在各种生物体。这种多功能性大量由MT相关蛋白（MAP）介导。例如，神经元MAP Tau是稳定脊椎动物神经系统轴突中的MT，因此为持久的轴突运输和神经元的长寿命提供了基础（Mandelkow等人，1994）。 Tau已经显示在体外直接结合MT，并且促进它们从α-/β-微管蛋白亚基的成核（Goode等人，1994）。最近，我们鉴定了称为"纤维素合酶的伴侣"（CC）的植物特异性蛋白质家族，其被证明结合MT并在盐胁迫下增强植物细胞中皮质MT阵列的动力学（Endler等，2015）。因此，CC被假定为帮助植物细胞应对胁迫条件，从而在不利生长条件下维持生物量生产。在这里，我们提供详细的实验信息在体外 MT结合测定，其允许评估感兴趣的蛋白质是否绑定到MT。该测定法在自旋向下方法中利用高分子量的MT，并且使得能够测定解离常数K d sub，其是蛋白质与MT的结合强度的量度。
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