| Synthetic Lethality Screens Using RNAi in Combination with CRISPR-based Knockout in Drosophila Cells
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] A synthetic lethal interaction is a type of genetic interaction where the disruption of either of two genes individually has little effect but their combined disruption is lethal. Knowledge of synthetic lethal interactions can allow for elucidation of network structure and identification of candidate drug targets for human diseases such as cancer. In Drosophila, combinatorial gene disruption has been achieved previously by combining multiple RNAi reagents. Here we describe a protocol for high-throughput combinatorial gene disruption by combining CRISPR and RNAi. This approach ...
[摘要] 合成的致死相互作用是一种遗传相互作用，其中两种基因之一的破坏单独具有影响，但它们的组合破坏是致命的。有关合成致死相互作用的知识可以帮助阐明网络结构和确定人类疾病如癌症的候选药物靶标。在果蝇中，组合基因破坏已经通过组合多个RNAi试剂而实现。这里我们通过组合CRISPR和RNAi来描述高通量组合基因破坏的协议。这种方法以前导致了高度可重现和保守的合成致死相互作用的识别（Housden等人，2015）。
背景 遗传相互作用的知识，如合成致死性，对于确定基因之间的功能关系可能是无价的。例如，酵母中的大规模遗传相互作用屏幕最近被用于组装全球“细胞功能的接线图”（Costanzo等人，2016）。或者，可以使用特定类型的遗传相互作用，例如合成致死相互作用来鉴定包括癌症在内的疾病的药物靶标（Kaelin，2005）。
＆nbsp;鉴定合成相互作用需要组合破坏两个基因。以前在果蝇细胞培养中实现该方法的方法是同时递送多个dsRNA试剂（例如，Fisher等人，2015）。然而，RNAi试剂具有局限性，包括脱靶效应和不完全靶标敲低，当多个试剂一起递送时，RNAi试剂复合。通过将CRISPR诱变与单个dsRNA处理相结合，可以避免这些问题，从而更简单地解释筛选结果并强化“点击”识别。
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| A Bioassay Protocol for Quorum Sensing Studies Using Vibrio campbellii
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Author:
Date:
2016-07-20
[Abstract] Quorum Sensing (QS), or bacterial cell-to-cell communication, is a finely-tuned mechanism that regulates gene expression on a population density-dependent manner through the production, secretion and reception of extracellular signaling molecules termed autoinducers (AIs). Given that QS plays an important role in bacterial biofilm formation and virulence factor production in many pathogenic strains, QS disruptors have become a hot topic in current antimicrobial research. There are several reporter strains exhibiting QS-regulated phenotypes that have been engineered for the identification of ...
[摘要] Quorum Sensing（QS）或细菌细胞与细胞间的通信是一种微调的机制，通过称为自体诱导物（AI）的细胞外信号分子的产生，分泌和接受，以群体密度依赖性方式调节基因表达。鉴于QS在许多致病菌株中的细菌生物膜形成和毒力因子产生中起重要作用，QS干扰物已经成为当前抗微生物研究的热门话题。存在几种报道菌株，其表现出QS-调节的表型，其已被工程化用于鉴定QS抑制剂，包括例如颜料产生（González和Keshavan，2006; Steindler和Venturi，2007），gfp < （gonzález和keshavan，2006;="" steindler和venturi，2007）或致死性基因融合下游qs控制的启动子（weiland-bräuer=""> et al 。，2015）。使用三个平行的QS电路，生物发光海洋细菌（Vibrio campbellii）（以前称为harveyi，Lin等人，2010）构成复杂的革兰氏阴性模型，存在广泛的知识，包括一系列突变生物传感器。在中。 campbellii ...
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| Longitudinal Bioluminescent Quantification of Three Dimensional Cell Growth
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Author:
Date:
2013-12-05
[Abstract] The use of three-dimensional (3D) cell culture systems is widely accepted as representing a more physiologically relevant means to propagate mammary epithelial and breast cancer cells. However, 3D cultures systems are plagued by several experimental and technical limitations as compared to their traditional 2D counterparts. For instance, quantifying the growth of mammary epithelial or breast cancer organoids longitudinally is particularly troublesome using standard [3H]thymidine or MTT assay systems, or using computer-assisted area calculations. Likewise, the nature of the ...
[摘要] 使用三维（3D）细胞培养系统被广泛接受为代表更多生理相关手段以增殖乳腺上皮和乳腺癌细胞。然而，与其传统的2D对应物相比，3D培养系统受到若干实验和技术限制的困扰。例如，使用标准的[3 H]胸苷或MTT测定系统或使用计算机辅助面积计算，纵向量化乳腺上皮或乳腺癌组织的生长是特别麻烦的。同样，在3D条件下由乳腺癌细胞形成的多细胞聚集体和类器体的性质阻止了细胞从3D基质的有效回收，这是耗时的并且导致假的结果的事件。这里描述的测定利用萤火虫荧光素酶的稳定表达作为定量在3D矩阵内传播的细胞的纵向生长的手段。该技术的主要优点包括其高通量性质和在规定的时间段内纵向跟踪单个孔的能力，从而降低与测定性能相关的成本。最后，该技术可以容易地与药物治疗和/或遗传操作组合以测定它们对3D类器官生长的影响。
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