Sleeping Beauty Transposon-based System for Rapid Generation of HBV-replicating Stable Cell Lines
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] The stable HBV-transfected cell lines, which based on stable integration of replication-competent HBV genome into hepatic cells, are widely used in basic research and antiviral drug evaluation against HBV. However, previous reported strategies to generate HBV-replicating cell lines, which primarily rely on random integration of exogenous DNA by plasmid transfection, are inefficient and time-consuming. We newly developed an all-in-one Sleeping Beauty transposon system (denoted pTSMP-HBV vector) for robust generation of stable HBV-replicating cell lines of different genotype. The pTSMP-HBV ...
[摘要] 稳定的HBV转染细胞系基于将复制能力的HBV基因组稳定整合到肝细胞中,广泛用于基础研究和针对HBV的抗病毒药物评估。然而,先前报道的产生HBV复制细胞系的策略(其主要依赖于通过质粒转染的外源DNA的随机整合)是低效且耗时的。我们新开发了一体化睡眠美容转座子系统(表示为pTSMP-HBV载体),用于稳定产生不同基因型的稳定HBV复制细胞系。 pTSMP-HBV载体含有HBV1.3拷贝基因组和双重选择标记(mCherry和嘌呤霉素抗性基因),允许通过红色荧光激活细胞分选和嘌呤霉素抗生素选择快速富集稳定转染的细胞。在该方案中,我们描述了构建HBV复制稳定细胞和系统评估这些细胞的HBV复制和病毒蛋白表达谱的详细程序。
【背景】慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染目前是一个主要的公共卫生负担,影响全球超过2.4亿人(Witt-Kehati et al。,2016)。慢性HBV患者患慢性活动性肝炎,肝硬化或原发性肝细胞癌(HCC)的风险升高(Schweitzer et al。,2015)。目前用干扰素-α或核苷类似物治疗并不能根除病毒,它们对清除乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用有限(Lucifora和Protzer,2016; Soriano et al。,2017) 。因此,迫切需要开发新的抗病毒抑制剂(Nassal,2015)。
用于评估新药抗HBV活性的细胞培养模型是新药开发的重要工具。稳定的HBV复制细胞系,携带复制能力的HBV基因组稳定整合到人肝癌细胞系(Huh7和/或HepG2)的基因组中,被广泛用于评估抗病毒药物的作用(Witt-Kehati ...
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In vitro Analysis of Ubiquitin-like Protein Modification in Archaea
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ubiquitin-like (Ubl) protein is widely distributed in Archaea and involved in many cellular pathways. A well-established method to reconstitute archaeal Ubl protein conjugation in vitro is important to better understand the process of archaeal Ubl protein modification. This protocol describes the in vitro reconstitution of Ubl protein modification and following analysis of this modification in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon serving as the model organism.
[摘要] 泛素样(Ubl)蛋白广泛分布于古细菌中并参与许多细胞途径。 为了更好地理解古细菌Ub1蛋白质修饰的过程,重建体外古细菌Ubl蛋白质缀合物的完善方法是很重要的。 该协议描述了Ubl蛋白质修饰的体外重建以及在作为模型生物的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中对这种修饰进行分析。
【背景】泛素(Ub)与靶蛋白共价连接的过程被称为泛素化,其控制真核细胞中大量的细胞过程(Glickman和Ciechanover,2002; Komander和Rape,2012)。遍在蛋白化由一系列酶(包括Ub激活酶(E1),Ub结合酶(E2s)和Ub连接酶(E3s))催化。泛素化的体外重建是确定酶之间或E3与蛋白质底物之间特异性的有用测定法(Zhao等人,2012)。在古细菌中,Ubl蛋白SAMP采用Ub折叠,并且与E1样酶UbaA催化的蛋白靶标异肽连接[Maupin-Furlow,(2014)综述]。尽管E1同系物在古细菌中广泛存在,但基于一级序列比较,在大多数古细菌中未预测经典E2或E3酶。我们最近对Haloferax volcanii的研究表明甲硫氨酸亚砜还原酶A(MsrA)是Ubl蛋白质修饰(sampylation)与UbaA一起在体内温和的氧化条件下和< (体外)(fu="">
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Design of Hybrid RNA Polymerase III Promoters for Efficient CRISPR-Cas9 Function
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Date:
2018-03-20
[Abstract] The discovery of the CRISPR-Cas9 system from Streptococcus pyogenes has allowed the development of genome engineering tools in a variety of organisms. A frequent limitation in CRISPR-Cas9 function is adequate expression levels of sgRNA. This protocol provides a strategy to construct hybrid RNA polymerase III (Pol III) promoters that facilitate high expression of sgRNA and improved CRISPR-Cas9 function. We provide selection criteria of Pol III promoters, efficient promoter construction methods, and a sample screening technique to test the efficiency of the hybrid promoters. A hybrid ...
[摘要] 来自化脓性链球菌的CRISPR-Cas9系统的发现使得在各种生物体中开发基因组工程工具成为可能。 CRISPR-Cas9功能的频繁限制是足够的sgRNA表达水平。 该协议提供了构建杂合RNA聚合酶III(Pol III)启动子的策略,其促进sgRNA的高表达和改善的CRISPR-Cas9功能。 我们提供Pol III启动子的选择标准,有效的启动子构建方法以及样品筛选技术来检测杂合启动子的效率。 为解脂耶氏酵母开发的杂交启动子系统将用作模型。
【背景】CRISPR(成簇定期间隔短回文重复序列)是细菌中发现的DNA序列的集合,其中含有先前曝光的病毒DNA片段(Marraffini和Sontheimer,2010)。片段被称为间隔区DNA,并且它们侧面是短的,重复的回文序列。细菌使用这些存储的间隔序列作为模板来表达RNA,以识别和攻击再次暴露的特定病毒。当与CRISPR相关(Cas)蛋白结合时,CRISPR-Cas系统可以识别和切割外源DNA或RNA,破坏病毒并保护宿主免受重复感染(Barrangou,2013)。
一种特定的CRISPR系统,来自化脓链球菌的II型CRISPR-Cas9已经被修改成用于基因组编辑的更简单的系统。利用这个系统,研究人员能够设计特定的单引导RNA(sgRNA)序列,它与具有上游原型间隔区相邻基序(PAM;'NGG')的目的基因的20bp序列互补(Jinek ...
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