| Optogenetic Tuning of Protein-protein Binding in Bilayers Using LOVTRAP
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Modern microscopy methods are powerful tools for studying live cell signaling and biochemical reactions, enabling us to observe when and where these reactions take place from the level of a cell down to single molecules. With microscopy, each cell or molecule can be observed both before and after a given perturbation, facilitating better inference of cause and effect than is possible with destructive modes of signaling quantitation. As many inputs to cell signaling and biochemical systems originate as protein-protein interactions near the cell membrane, an outstanding challenge lies in ...
[摘要] [摘要] 现代显微镜方法是研究活细胞信号转导和生化反应的强大工具，使我们能够观察这些反应的时间和位置，从细胞水平到单个分子。利用显微镜，可以在给定的扰动之前和之后观察每个细胞或分子，比起破坏性的信号定量方法，可以更好地推断因果关系。由于细胞信号传导和生化系统的许多输入源于细胞膜附近的蛋白质-蛋白质相互作用，因此一个巨大的挑战在于控制时间，位置 以及这些独特环境中蛋白质与蛋白质相互作用的程度。在这里，我们详细介绍了在封闭的显微镜系统中使用这种基于时空的蛋白质-蛋白质相互作用系统，在支持的脂质双分子层上使用基于LOVTRAP的光反应性蛋白质-蛋白质相互作用系统的程序。系统可以在几秒钟内做出响应，并且可以将细节图案化到1微米级别。我们使用了该技术来解锁T细胞信号传导的基本方面，并且该方法可推广到许多其他细胞信号传导和生化环境。
背景技术细胞信号传导和细胞生物学中的问题通常集中在细胞如何感知和响应其环境上。进行这些细胞决定的信号级联反应包含的蛋白质可以在几秒钟到几分钟的时间内将纳米级移动到微米级。某些常用方法，例如蛋白质印迹，qPCR ...
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| Pentylenetetrazole (PTZ)-induced Convulsion Assay to Determine GABAergic Defects in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABAA receptor antagonist and is used to monitor presynaptic defects in the release of the inhibitory neurotransmitter GABA. PTZ is a competitive inhibitor of GABA, and prevents binding of GABA on the GABAA receptors present on the surface of muscle. In the absence of GABA binding, the excitatory to inhibitory signal ratio increases resulting in a convulsive phenotype. This assay provides a fast and reliable method to detect presynaptic defects in GABAergic synaptic transmission. The assay is based on correlating the extent of convulsions ...
[摘要] 戊四唑（PTZ）是GABA A 受体拮抗剂，用于监测抑制性神经递质GABA释放中的突触前缺陷。 PTZ是GABA的竞争性抑制剂，并且阻止GABA与肌肉表面上存在的GABA A 受体结合。 在没有GABA结合的情况下，抑制信号比的兴奋性增加导致惊厥表型。 该试验提供了一种快速可靠的方法来检测GABA能突触传递中的突触前缺陷。 该测定基于将惊厥的程度与突触前GABA释放缺陷的程度相关联。
【背景】突触是介导突触传递的不对称细胞间连接。它们构成了能够执行复杂行为的大脑电路的基本单元。动作电位的到达通过电压门控钙通道引起钙流入，导致质膜的去极化。在这种突触前去极化后，突触囊泡与质膜融合，通过高度控制的过程将其内容物释放到突触间隙中（Sudhof，1995; Sudhof，2004）。
运动是 Caenorhabditis elegans 中突出的行为输出。产生协调的背腹窦弯曲的神经回路允许 C中的正常运动。线虫。运动行为在多个层面上进行协调，并且涉及由中间神经元处理的多个感觉神经元整合多种感觉线索，并最终在神经肌肉接头（NMJ）处直接变化（de Bono和Maricq，2005; Bargmann，2012）。 C.线虫 NMJ有三个主要组成部分;兴奋性胆碱能运动神经元，抑制性GABA能神经运动神经元和突触后肌细胞（White et ...
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| Bacterial Microcolonies in Gel Beads for High-throughput Screening
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] High-throughput screening of a DNA library expressed in a bacterial population for identifying potentially rare members displaying a property of interest is a crucial step for success in many experiments such as directed evolution of proteins and synthetic circuits and deep mutational scanning to identify gain- or loss-of-function mutants.
Here, I describe a protocol for high-throughput screening of bacterial (E. coli) microcolonies in gel beads. Single cells are encapsulated into monodisperse water-in-oil emulsion droplets produced with a microfluidic device. The aqueous ...
[摘要] 在细菌群体中表达的DNA文库的高通量筛选用于鉴定显示感兴趣性质的潜在稀有成员是在许多实验中成功的关键步骤，例如蛋白质和合成回路的定向进化以及用于鉴定增益的深度突变扫描 - 或功能丧失的突变体。
在这里，我描述了一种用于高通量筛选凝胶珠中细菌（大肠杆菌）微菌落的方案。将单细胞包封成用微流体装置产生的单分散油包水乳液液滴。水溶液还含有琼脂糖，其在冰上冷却时凝胶化，从而在液滴内部形成固体凝胶珠。在乳液温育期间，细胞在珠内生长成单克隆微菌落。在从乳液中分离凝胶珠并通过荧光激活细胞分选（FACS）分选后，从凝胶珠中回收细菌，然后准备进行进一步的分选，诱变或分析。为了通过FACS分类，该方案需要荧光读数，例如荧光报告蛋白的表达。测量微小菌落的平均荧光信号降低了高表型细胞间变异性的影响，并且与单细胞分选相比提高了灵敏度。我们应用这种方法在ON和OFF状态下对pBAD启动子文库进行分类（Duarte et al。，2017）。
【背景】荧光激活细胞分选（FACS）具有> 10 7 事件/ h的无与伦比的筛选通量（Davies，2012）。然而，通过FACS根据其荧光分选单个细胞以筛选合成回路的文库（Schaerli和Isalan，2013）经常受到高表型细胞间变异性的阻碍。或者，可以对水凝胶珠中所含的小细胞集落（微集落）进行分类（Weaver ...
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