| Transcytosis Assay for Transport of Glycosphingolipids across MDCK-II Cells
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Absorption and secretion of peptide and protein cargoes across single-cell thick mucosal and endothelial barriers occurs by active endocytic and vesicular trafficking that connects one side of the epithelial or endothelial cell (the lumen) with the other (the serosa or blood). Assays that assess this pathway must robustly control for non-specific and passive solute flux through weak or damaged intercellular junctions that seal the epithelial or endothelial cells together. Here we describe an in vitro cell culture Transwell assay for transcytosis of therapeutic peptides linked ...
[摘要] 单细胞厚粘膜和内皮屏障上的肽和蛋白质货物的吸收和分泌通过活性内吞和囊泡运输发生，其连接上皮细胞或内皮细胞（管腔）的一侧与另一侧（浆膜或血液）。 评估该途径的测定必须通过弱的或受损的细胞间连接强有力地控制非特异性和被动的溶质通量，所述细胞间连接将上皮细胞或内皮细胞密封在一起。 在这里，我们描述了一种体外>细胞培养Transwell测定法，用于与各种鞘糖脂GM1共价连接的治疗性肽的转胞吞作用。 我们最近使用该测定开发了技术，该技术利用跨上皮细胞屏障的脂质分选的内源机制，以实现肽和蛋白质治疗剂的口服递送。
【背景】
大分子穿过覆盖粘膜表面的单细胞厚的上皮屏障和衬在供给心肌和脑的血管的紧密内皮屏障上的运输通过内吞过程发生，该内吞过程将这些极化细胞的一侧与另一侧连接。该过程称为转胞吞作用（Garcia-Castillo et al。>，2017）。通过受体介导的内吞作用和穿过消化道和呼吸道粘膜的囊泡运输的免疫球蛋白的吸收和分泌最着名的是这一过程。对转胞吞作用的兴趣也受到利用该途径在紧密上皮和内皮屏障上递送治疗性肽和蛋白质的潜力的刺激（Thuenauer 等人，>，2017）。
转胞吞作用是一种活跃的（ATP驱动的）过程。在一些情况下，通过细胞间紧密连接在细胞周围被动扩散可以发生大分子跨越紧密上皮和内皮屏障的转运（Fung ...
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| In vitro Demonstration and Quantification of Neutrophil Extracellular Trap Formation
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] In the recent decade, neutrophil extracellular traps (NETs) have been identified and confirmed as a new anti-microbial weapon of neutrophils. In this protocol, we describe easy methods to demonstrate NET formation by immunofluorescence staining of extracellular chromatin fiber with anti-DNA/Histone H1 antibody and quantification of NETs by using a non-cell-permeable DNA specific dye Sytox orange.
[摘要] 近十年来，嗜中性粒细胞胞外捕获物（NETs）已被鉴定并确认为一种新的抗微生物中性粒细胞武器。 在该方案中，我们描述了通过使用抗DNA /组蛋白H1抗体的细胞外染色质纤维的免疫荧光染色和通过使用非细胞可渗透的DNA特异性染料Sytox orange来定量NETs的简便方法来证明NET形成。
【背景】嗜中性粒细胞构成循环白细胞中最大的进化保守部分。他们通过各种机制建立了针对病原体的第一道防线，包括形成嗜中性粒细胞胞外捕获物（NETs）。在此过程中，活化的嗜中性粒细胞从细胞核中排出染色质纤维。入侵的病原体然后被捕获在染色质网络内并被高度浓缩的NET缠结的抗微生物蛋白如髓过氧化物酶（MPO）和弹性蛋白酶（Brinkmann等人，2004）杀死。然而，NETs是一把双刃剑;来自过度活化的嗜中性粒细胞的无限制的NET形成也可能导致严重的组织损伤，例如通过NET的组蛋白组分的细胞毒性作用（Saffarzadeh等人，2012）。中性粒细胞过度活化并具有增强的形成NETs的能力的病理状况的一个例子是系统性红斑狼疮。狼疮患者血清中针对双链DNA及其它组分的抗体水平升高（Knight and Kaplan，2012; Yu and ...
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| Affinofile Assay for Identifying Macrophage-Tropic HIV-1
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Author:
Date:
2014-07-20
[Abstract] The ability to enter monocyte-derived macrophage (MDM) in vitro is commonly used to define macrophage-tropic HIV-1 despite the fact that viruses vary continuously in their ability to enter MDMs in vitro, and MDMs vary in their ability to support HIV-1 entry (Joseph et al., 2014; Peters et al., 2006). This makes it difficult to distinguish viruses that are adapted to replicating in macrophage from those that are adapted to replicating in T cells. We use the Affinofile cell line ( Johnston et al., 2009) to assay for macrophage tropism by ...
[摘要] 体外进入单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM）的能力通常用于定义巨噬细胞向性HIV-1，尽管事实上病毒在体外进入MDM的能力不断变化。/em>，并且MDMs支持HIV-1进入的能力不同（Joseph等人，2014; Peters等人，2006）。这使得难以将适于在巨噬细胞中复制的病毒与适于在T细胞中复制的病毒区分开。我们使用Affinofile细胞系（Johnston等人，2009）通过利用巨噬细胞嗜性HIV-1具有增强的进入表达低水平CD4的细胞的能力的事实来测定巨噬细胞趋向性（Joseph等人，2014; Peters等人，2006; Duenas-Decamp等人，2009; Dunfee等人et al。，2006; Gorry et al。，2002; Martin-Garcia et al。，2006; Peters et al。， ，2004），并且亲和素细胞可以被诱导以表达宽范围的CD4密度（Johnston等人，2009）。我们诱导Affinofile细胞表达高或低CD4，用假型报告病毒感染那些细胞，并且量化在低CD4相对于高CD4的感染性的百分比感染性。巨噬细胞嗜性病毒在低CD4下具有增强的感染能力。使用这种方法，我们已经发现HIV-1的巨噬细胞向性菌株相对稀少，并且大多数HIV-1变体需要高水平的CD4进入细胞，我们称为R5 T细胞向性的表型。
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